CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y MOLECULAR DE BACTERIAS
ÁCIDO LÁCTICAS EN GANADO JERSEY DE TIERRAS ALTAS[1]
Melvys Jacqueline
Vega-Quintero[2]; Rosa Itzela Quintero-Montenegro[3];
Howard Junca[4]
RESUMEN
Las bacterias del ácido láctico (BAL) son microorganismos unicelulares
procariotas responsables del proceso de fermentación de los alimentos como:
leche, carnes y vegetales, es decir, degradan carbohidratos y producen ácido
láctico. La composición de bacterias del ácido láctico en la leche, constituyen
factores importantes en la elaboración industrial de productos lácteos de alta
calidad. La diversidad de bacterias del ácido láctico presentes en la leche de
la raza vacuna Jersey, supone indicadores biológicos de los procesos de
fermentación láctica, para la fabricación de leche fermentada, quesos, yogurt y
otros productos derivados de la leche. El tipo de especie bacteriana utilizado
como iniciador en el proceso de fermentación, refiere un factor determinante en
la calidad y características sensoriales del producto final. El objetivo es
determinar las características fenotípicas y genotípicas de las bacterias del
ácido láctico en la leche de ganado Jersey. La raza Jersey es un ganado vacuno
británico introducido en las Tierras Altas de Chiriquí, cuyo potencial como
fuentes de producción de leche en Panamá, específicamente en el área de estudio,
es de gran interés en el desarrollo socioeconómico y es valorada como una raza
de lechería en la actividad ganadera. El alcance de la investigación está
enmarcado en la identificación de las bacterias del ácido láctico por métodos
moleculares y actividad enzimática. Como hallazgo se plantea la diversidad
biológica de Streptococcus, Streptobacillus
y Bifidobacterium identificada en la leche del ganado Jersey, con actividad
enzimática de 2% heterofermentativa y 92% homofermentativa, las cuales revelan
beneficios para la fabricación de lácteos.
Palabras clave: Bacterias acido lácticas, fenotipo, fermentación, genotípico, indicadores biológicos.
MOLECULAR CHARACTERIZATION OF LACTIC ACID BACTERIA
IN JERSEY CATTLE MILK FROM TIERRAS ALTAS DISTRICT
ABSTRACT
Lactic acid bacteria (LAB) are unicellular prokaryotic microorganisms
responsible for the fermentation process of foods such as: milk, meat and
vegetables, that is, they degrade carbohydrates and produce lactic acid. The
composition of lactic acid bacteria in milk are important factors in the
industrial production of high-quality dairy products. The diversity of lactic acid
bacteria present in the milk of the Jersey cattle breed is biological
indicators of the lactic acid fermentation processes for the manufacture of
fermented milk, cheese, yogurt and other products derived from milk. The type
of bacterial species used as initiator in the fermentation process is a
determining factor in the quality and sensory characteristics of the final
product. The objective is to determine the phenotypic and genotypic
characteristics of lactic acid bacteria in the milk of Jersey cattle. The
Jersey breed is a British cattle breed introduced in the Chiriquí Highlands,
whose potential as sources of milk production in Panama, specifically in the
Chiriquí Highlands, is of great interest in socio-economic development and is
valued as a dairy breed in livestock activity. The scope of the research is
framed in the identification of lactic acid bacteria by molecular methods and
enzymatic activity. As a finding, the biological diversity of Streptococcus,
Streptobacillus and Bifidobacterium identified in the milk of Jersey cattle is
proposed, with enzymatic activity of 2% heterofermentative and 92%
homofermentative, which reveal benefits for the manufacture of dairy products.
Keywords:
Lactic acid bacteria, phenotype, fermentation, genotypic, biological
indicators.
Introducción
La
investigación se fundamenta en la identificación y análisis de la diversidad
biológica de las bacterias del ácido láctico presentes en la leche entera de la
raza de ganado vacuno Jersey, en el distrito de Tierras Altas de la provincia
de Chiriquí, República de Panamá. El objetivo del proyecto es evaluar la
composición de bacterias del ácido láctico en la leche entera de la raza Jersey
como potencial para la producción de derivados lácteos probióticos de calidad
en la industria láctea. El aporte de la investigación al conocimiento sobre la
composición microbiológica de la leche entera de la raza Jersey, radica en la
identificación de la diversidad de especies de bacterias ácido láctico, para la
fermentación y generación de nuevos modelos de procesos lácteos en la
industria. El ganado vacuno Jersey, es una raza británica (Isla Jersey)
productora de leche y carne, con mejor composición nutricional y propiedades
químicas a diferencia de las razas Guernsey, Suizo Pardo, Ayrshire y Holstein,
de acuerdo con el análisis comparativo (Vega y Quintero, 2023) y según las
referencias aportadas por De los Reyes et al. (2010).
Las bacterias del ácido
láctico, lácticas o lacto-bacterias, son microorganismos unicelulares
procariotas, es decir, organismos constituidos por una sola célula, cuyo núcleo
no está definido o delimitado por una membrana nuclear (Ville, 1996). Se
presentan en tres formas: esféricas denominadas cocos, cilíndrica denominados
bacilos y cilíndrica divididas en dos partes en sus extremos denominadas bífidas.
Las bacterias lácticas con formas esféricas y cilíndricas se presentan en
agrupaciones en cadenas, las cuales se denominan Streptococos y Streptobacilos,
respectivamente (Carroll et al., 2016).
Además, las bacterias
lácticas no requieren de oxígeno para los procesos metabólicos (respiración),
por lo que, las identifica anaeróbicas. La respiración celular se realiza, a
través, de la ruta metabólica anaeróbica conocida como fermentación láctea o
fermentación del ácido láctico, el cual ocurre en el citosol de la célula y en
el que se oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y el producto de
desecho es el ácido láctico (Madigan y Martiniko, 2009).
También,
pueden ser identificadas en cepas de bacilos, cepas de cocos o cepas de bacilos
bífidas y son reconocidas como Gram positivas (+) por la coloración púrpura
(azul intenso o morado) de acuerdo con la tinción diferencial de Gram
(Ramírez-López y Vélez-Ruíz, 2016). López-Jácome et al. (2014) indica que las bacterias Gram (+) retienen el
cristal violeta después de la decoloración, debido a que tienen pared celular
gruesa, de allí el color que las identifica.
Ramírez-López y Vélez-Ruíz (2016) afirman que fisiológicamente las
bacterias del ácido láctico pueden generar la fermentación homoláctica o
heteroláctica y procesos enzimáticos de oxidasa y catalasa negativa.
En
la industria, las bacterias lácticas son importantes en procesos de producción
de quesos, yogurt, mantequilla, leche fermentada, vinagre, vinos, embutidos,
vegetales encurtidos, en la fabricación de medicamentos, cosméticos y de otros
productos químicos, así como en el tratamiento de las aguas residuales (Madigan
y Martiniko, 2009).
Las leches fermentadas son productos preparados a partir
de la leche entera, parcial o totalmente descremada, concentrada o bien
sustituida, total o parcialmente con leche descremada en polvo, pasteurizada o
esterilizada y fermentada por medio de microorganismos específicos, siendo las
principales las bacterias lácticas (García et al., 2010). Cuando las
fermentaciones de la leche son realizadas por las bacterias lácticas se
producen metabolitos como el ácido láctico, etanol, bacteriocinas y muchos
otros compuestos que conservan la leche y le imparten características
organolépticas distintivas (Shirai et al., 1996).
Las
bacterias lácticas son un grupo de microorganismos probióticos representados
por varios géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas
en común. Su clasificación está basada en la morfología, modo de fermentación
de la glucosa (homofermentativas y heterofermentativas), el crecimiento a
diferentes temperaturas, la configuración del ácido láctico producido y la
habilidad para crecer en medios altamente alcalinos o ácidos. Describe que la
función de géneros de bacterias lácticas y otros microorganismos como
probióticos, determinan las propiedades de las bacterias para la conservación y
desarrollo de las características sensoriales de los alimentos como el olor,
sabor, textura y calidad nutritiva. Además, que las principales aplicaciones de
la bacteria lácticas se producen en la elaboración de las leches fermentadas y
diversas variedades de quesos (Ramírez et al., 2011).
Para
el estudio de la identificación y la genética de los microorganismos, Hernández,
(2003)
refiere algunas técnicas de biología molecular, entre las cuáles menciona la
técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR),
electroforesis de ácidos nucléicos y proteínas, secuenciación de DNA clonación
de fragmentos de DNA. En microbiología
permiten la detección de fragmentos de ácidos nucleicos (DNA o RNA) que son
específicos de cada microorganismo, en diferentes materiales o muestras.
Además, permiten la identificación de la especie bacteriana (Stamboulian, 2019).
El aislamiento, identificación y
caracterización de grupos de bacterias lácticas en una muestra de queso
venezolano ahumado andino artesanal realizado por Alvarado et al. (2007), se
identificó tres géneros de bacterias Lactococcus,
Lactobacillus y Leuconostoc. Además, se describieron la morfología de las
cepas y se observó la actividad metabólica como cultivos iniciadores.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de Estudio
La zona de estudio la
constituye el distrito de Tierras Altas, el cual se localiza en la provincia de
Chiriquí, República de Panamá, en la Cuenca Hidrográfica No. 102 denominada
Chiriquí Viejo - Cuenca Alta (Figura 1). Está conformada por los corregimientos
de Volcán, Cerro Punta, Cuesta de Piedra, Nueva California y Paso Ancho. Se
caracteriza por su zona de vida bosque muy húmedo con 43,26% de la superficie y
bosque húmedo tropical con 15,93%. Comprende clima oceánico de montaña y clima
tropical de montaña media y alta. Los
suelos de textura mimosa, color chocolate oscuro, formas irregulares con alta
permeabilidad. La precipitación media anual de la cuenca es de 3,322 mm
(Arialridad Nacional del Ambiente [ANAM], 2014).
Se realizó inspección en la
zona de estudio, se tomaron datos de campo a través de observaciones in situ, sobre las características de
las fuentes de extracción leche de ganado Jersey. También, se recopiló la
información sobre las características biogeográficas del área de estudio con un equipo Garmin GPSMAP 66i. Se elaboró la cartografía del área de estudio a través de Sistema de Información Geográfica (SIG),
cuyos datos fueron tomados en campo.
Se seleccionaron seis
sitios de muestreos (fincas Grado A), en el corregimiento de Volcán, distrito
de las Tierra Altas. En cada sitio se realizó un muestreo en frecuencia de 15
días por período de dos meses (diciembre a enero). En total se tomaron 24
muestras, cada muestra fue compuesta tomada de tercer chorro de la ubre de una
vaca Jersey, previa desinfección, a través de equipo de ordeño instalado en los
cuatro pezones. La vaca Jersey seleccionada como ejemplar en cada finca fue
rotulada en la oreja con un dispositivo, para la identificación en los
subsiguientes muestreos. Las muestras fueron preservadas en envases
esterilizados y en etanol absoluto en proporción de 4:9. Se aplicaron pruebas
microbiológicas a cada muestra, las cuales se realizaron en el laboratorio
microbiológico del Centro de Producción e Investigaciones Agroindustriales
(CEPIA), Universidad Tecnológica de Panamá y Laboratorio Microbiomas Foundation, Colombia. El análisis de datos se realizó con software especializado en
estadística Statistical Package for the
Social Science-SPSS, 2017 y por comparación genética microbiana (Lozupone et
al., 2011).
Las pruebas microbiológicas realizadas fueron las siguientes:
1. Determinación
de las características fenotípicas de las bacterias del ácido láctico.
·
Aislamiento,
purificación y preservación de las bacterias del ácido láctico: Este proceso
implica la obtención de colonias bacterianas del ácido láctico puras y libres
de contaminantes. Las bacterias del ácido láctico de 24 muestras se aislaron a
través del método de siembra con asada en medio de cultivo de agar triptona
soja (TSA), incubada a 38° C por 24 horas. La purificación se realizó mediante
la técnica de Baird Parker incubada a la misma temperatura y tiempo. La
preservación de las colonias de bacterias del ácido láctico se realizó en caldo
luria (luria Bertani) incubada a 35° C por 24 horas (Acevedo et al., 2013).
·
Identificación
morfológica y agrupación de las bacterias del ácido láctico: Se emplearon
técnicas de frotis, fijación y tinción diferencial para la identificación de
bacterias Gram positivas y negativas (Aquiahuati-Ramos et al., 2012). Las
placas de bacterias del ácido láctico obtenidas fueron observadas en el
microscopio Nikon Eclipse E200, con magnificación de 40x, 100x, 400x y 1000x (Nikon Company, 2016).
·
Identificación
de cepas y recuento de colonias: El método empleado permitió el conteo preciso
de células de bacterias del ácido láctico. Se realizó mediante el método de
tinción de las bacterias con fluorescente naranja acridina e iluminación a
longitud de onda determinada, cuyas señales fluorescentes emitidas por las
bacterias fueron recogidas por un foto-detector. El conteo se realizó
Arialmáticamente en el microscopio (Heer, 2007).
·
Determinación
de la oxidasa y catalasa: Para detectar la enzima oxidasa, se empleó la prueba
de oxidasa a través de un método directo, el cual activa la reacción enzimática
del sistema citocromo oxidasa para la identificación de bacterias patógenas
como la Neisseria (+) y la Pseudomonas, que suponen contaminantes de la leche. Para esta
prueba se utilizó cultivo bacteriano de las muestras de leche y la solución
acuosa de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs) al
1%, el cual tiñe las colonias oxidasa positiva de color lavanda que degrada a
púrpura, ante la presencia de las bacterias indicadas. Para la detección de la enzima catalasa se
aplicó la prueba de catalasa. Esta enzima se encuentra en las bacterias
patógenas Streptococcus y cataliza la
descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, lo que supone
contaminación bacteriana de la leche. Se utilizó el peróxido de hidrógeno al
30% y cultivo bacteriano de las muestras de leche (Fernández et al., 2010).
·
Determinación
de la actividad enzimática: Mediante
la siembra por estrías en medio de cultivo M5, se determinaron las cepas como
homolácticas o heterolácticas (elaborado con un monosacárido denominado
fructuosa como fuente de carbono), incubadas a 35° C. Se consideran
homolácticas cuando el medio cambia a color verdoso y heteroláctica cuando no
hay cambio de color (celeste) (Zuñiga et al., 1993).
Los
cultivos fueron observados en Estereoscopio Binocular SFX-33 OPTIKA.
·
Determinación de la
cinética de crecimiento de las bacterias del ácido: El estudio del
comportamiento de crecimiento poblacional de las cepas de bacterias del ácido
láctico se llevó a cabo a través de este procedimiento. Se inoculó 100 ml de
leche al 100% concentrada pasteurizada con 1 ml de agua peptonada preparada con
103 UFC/ml de la cepa de bacterias del ácido
láctico a analizar. Para evaluar el recuento (log10 UFC g-1) en función del tiempo, se tomaron muestras de la anterior preparación,
se inocularon en agar MRS y M17, Lactobacillus
y Lactococcus, respectivamente. La incubación se realizó a 34° C por 8, 16,
24, 32, 48, 56, 64 y 72 horas. El conteo se realizó mediante observaciones
macroscópicas, cámara de Neubauer y luego se elaboró la curva de crecimiento
bacteriano (Ramírez-López y Vélez-Ruíz, 2016). Los cálculos paramétricos
de crecimiento de las bacterias del ácido láctico se realizaron mediante el
método propuesto por (Infansón y Rojas, 2016).
·
Determinación del
antagonismo cruzado de las bacterias del ácido láctico: Este proceso implicó la
identificación de cepas compatibles para su aplicación potencial en la
iniciación de fermentaciones lácticas. Se utilizaron 100 μl de cultivo de bacterias del ácido láctico
procedente de la leche, por cada 30 ml de caldo (Agar MRS - Becton Dickinson
France, S.A.). Luego de la solidificación de las muestras, se hizo cuarto
pocillos en el agar y se agregó 100 μl del sobrenadante libre de células. Se
aplicó refrigeración a 4° C, incubación a 30° C por 24 horas. Concluido el
periodo, se verificó si existió la inhibición de crecimiento de bacterias del
ácido láctico, mediante la presencia de halos, indicador de incompatibilidad o
antagonismo (Ramírez-López y Vélez-Ruíz, 2016).
2. Determinación
de las características genotípicas (moleculares) de las bacterias ácido
lácticas.
Las
características genotípicas corresponden al conjunto de información genética
contenida en el DNA (genoma), la cual identifica en forma específica cada
especie, en este caso las bacterias acido lácticas. El método para la
identificación se basó en la extracción y purificación del DNA, la
amplificación génica, secuenciación genética y el análisis bioinformático.
Extracción y purificación del DNA: Consistió
en la lisis o rompimiento de las estructuras contenidas en el citoplasma, la
liberación de los líquidos, la retirada o purificación de las sustancias y la
detección de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), métodos aplicados
con base en Olivares, 2020 y Villegas-Plazas
et al., 2019. La
extracción a base de dodecil sulfato sódico (SDS) y bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB), adición de buffer TE 1x, realización de lisis
mecánica e incubaciones en frío (Blanco-Jarvio
et al., 2014).
Amplificación Génica: Se refiere al aumento en el número de copias de un fragmento de DNA,
con la finalidad de aumentar el número de copias de un gen en el genoma de las
bacterias del ácido láctico con base en las técnicas de la Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR), descritas en (Crespo et al., 2011). El procedimiento
consistió en preparar la mezcla de PCR: 10 ng de DNA extraído molde, regulador
de la Taq DNA Polimerasa (1X) (Invitrogen, Brazil), MgCl2 (2 mM),
los iniciadores (16S SENSE y 16S ANTISENSE) (0.4 µm), Taq DNA Polimerasa (IU) (Invitrogen). La mezcla se utilizó en las
reacciones de amplificación utilizando un termociclador de DNA (TECHNE Inc.
Burlington, NJ, U.S.A) a 35 ciclos en condiciones desnaturalización de 94° C, 1
min, alineamiento a 54° C, 1 min, polimerización a 72° C, 1 min. Los productos
finales de la reacción en cadena de la polimerasa fueron analizados en gel de
agarosa al 1% con regulador TAE 1X, teñido con Bromuro de etidio. El corrido
del gel se realizó por 2 horas (Ramos-Izquierdo et al., 2009).
Secuenciación
Genética: Se refiere a la ordenación y construcción de
los genotipos del DNA (16S) de las bacterias del ácido láctico. La
secuenciación se realizó por el método de microarrays, en el cual se empleó un
soporte poroso (cristal) para facilitar la miniaturización. La detección de los pares de nucleótidos se
basó en la técnica de fluorescencia y desarrollo de oligonucleótidos. Se
realizó de acuerdo con los procedimientos descritos por (Campion y Canul,
2004).
Análisis
Bioinformática (bancos de datos genéticos): Identificación de especies de las bacterias
del ácido láctico, se realizó por comparación de los genotipos obtenidos con la
secuenciación genética y las reportadas en los bancos de datos (Acceso a datos
Beta Diversidad para comparación), referenciadas en Villegas-Plazas et al. (2019).
Resultados y discusión
1.
Características fenotípicas de las bacterias del ácido
láctico.
§ Morfología,
Agrupación, Cepas y Recuento de las Bacterias del Ácido Láctico
Se
muestra tres tipos de cepas de bacterias del ácido láctico (BAL) identificadas
en la leche de ganado Jersey, las cuales son: los bacilos, bifidobacilos y los
cocos (Cuadro 1). De cada muestra se
obtuvo un cultivo puro que se caracterizó por el tipo de cepa (especie)
identificada, por lo cual, se derivaron 11 cepas de bacilos con recuento total
de 33 colonias promedio, una cepa de bifidobacilos con recuento total de dos
colonias promedio y 12 cepas de cocos con recuento total de 41 colonias
promedio. Significa que la proporción de cepas encontradas representa el 44% bacilos,
8% de bifidobacilos y 48% cocos. La mayor cantidad de colonias se encuentra en
los cocos. La morfología identificada para las cepas de bacilos corresponde a
cilíndricas; para las cepas bifidobacilos la morfología identificada es
cilíndrica con sus extremos en forma de V, mientras que para los cocos la forma
identificada es redonda. De acuerdo con las observaciones microscópicas, las
formas y agrupaciones de las cepas de bacilos se presentaron en forma de bastón
dispuestas en cadena, por lo que, se identificaron como estreptobacilos (Streptobacillus) (Figura 2). Las cepas
de cocos se presentaron en forma circular y en agrupaciones en cadena, las
cuales se identificaron como estreptococos (Streptococcus)
(Figura 3). Las cepas bifidobacilos se identificaron cilíndricas dividido en
dos partes en los extremos y en agrupaciones ramificadas (Figura 4). Los resultados coinciden con los tipos de
cepas, morfología y agrupaciones descritas por Carroll et al., 2016.
Según
la tinción diferencial Gram positiva (+) o negativa (-), (Cuadro 1), las cepas
de bacilos, bifidobacilos y las cepas de cocos se reportaron como Gram (+), por
el color púrpura (azul intenso). Por consiguiente, se identificaron Streptobacillus Gram (+), Streptococcus Gram (+) y Bifidobacillus Gram (+). Significa que
las bacterias identificadas pertenecen al grupo de bacterias del ácido láctico
(BAL). Lo anterior revela la diversidad de especies de bacterias acido
lácticas, las cuales influyen en la producción y calidad de productos lácteos,
por sus cualidades aromáticas y velocidad de fermentación láctica. Por comparación con los resultados de Ramírez-López
y Vélez-Ruíz (2016), se reporta que las bacterias del ácido láctico
corresponden a Gram (+) y pueden tener variabilidad de formas, agrupación y
características influyentes en la fermentación de la leche, por lo que,
constituye un potencial de interés en los procesos lácteos. En los seis sitios
de toma de muestra, las bacterias acido lácticas se distribuyeron en forma
heterogénea en abundancia y diversidad.
§ Catalasa,
Oxidasa y actividad enzimática de las Bacterias del Ácido Láctico
En cuanto a las pruebas de oxidasa y catalasa (Cuadro 2), se presentaron
negativas para las cepas de bacilos, bifidobacilos y cocos, puesto que, en las
pruebas no hubo producción de gas, lo que significa que las enzimas oxidasa y
catalasa están ausentes en estas cepas. El proceso indica que las cepas de
bacilos, bifidobacilos y cocos corresponden a bacterias anaerobias (respiración
celular en ausencia de oxígeno). Por lo tanto, la vía de respiración celular es
la fermentación. En las 24 muestras analizadas (Cuadro 2) se identificó dos
tipos de actividad enzimática de fermentación, las cuales son: heteroláctica y
homoláctica. Las muestras M6 y M13 reportadas con cepas de bacilos (Streptobacillus), fueron las únicas
donde se identificó la fermentación heteroláctica, ya que, el medio no cambio
de color, permaneció en color celeste (Figura 5 a). Significa que el 2% de las
muestras totales de las bacterias del ácido láctico (BAL) corresponden a
heterofermentativas, por lo tanto, este grupo de cepas utilizan la ruta de la
pentosa para el proceso de fermentación láctica. La fermentación homoláctica,
se identificó en las 22 muestras restantes (M1 a M5; M7 a M12 y M14 a M24),
reportadas con cepas de bacilos, bifidobacilos y cocos (Streptobacillus, Bifidobacillus y Streptococcus), debido al cambio
de color del medio verdoso (Figura 5 b). Refiere que el 92% de las muestras
totales de BAL son homofermentativas, por consiguiente, degradan glucosa por la
vía glucólisis en la fermentación láctica. Estos resultados guardan similitud,
con los reportados por Ramírez-López y Vélez-Ruíz (2016), donde afirma dos
aspectos importantes de los análisis sobre las cepas de bacterias del ácido
láctico a) que aquellas cepas con resultado de catalasa y oxidasa negativa no
tienen producción de gas al adicionar H2O2 b) las
bacterias del ácido láctico se consideran homolácticas, aquellas cepas cuyo
medio cambia a verdoso; mientras que las cepas que no producen cambios en el
color del medio (celeste) se consideran heterolácticas. La implicación que
tiene estos hallazgos en los procesos industriales lácteos, es que la leche
derivada del ganado Jersey posee características microbiológicas, bioquímicas y
actividad enzimática diversas, que aportan diferentes rutas metabólicas para
degradar los carbohidratos (lactosa). Por lo tanto, podrían reducir el tiempo de proceso, sabor,
color y olor del producto final.
§
Cinética de Crecimiento de las Bacterias del Ácido Láctico
El
comportamiento de las cepas obtenidas de la cinética de crecimiento de las bacterias
del ácido láctico se muestra en la curva de crecimiento en función a los
diferentes tiempos tomados.
La
cinética de crecimiento poblacional de las bacterias del ácido láctico (Cuadro
3), refieren que la población de células en la muestra M1 en el medio de
cultivo Agar MRS que identifica las cepas de Streptobacillus (conocidas como Lactobacillus), en comparación con población de
células en la muestra M24 en Agar M17, que determina las cepas de Streptococcus (conocidas como Lactococcus), a temperatura
estandarizada a 34° C, difieren en el crecimiento poblacional. Los resultados
se reflejaron en dos muestras, ya que, se consideró las pruebas en la fase
inicial y la fase final de tomas de muestras. Las especies Lactobacillus y Lactococcus identificadas son susceptibles a
responder al crecimiento en medios de cultivo Agar MRS y Agar M17,
respectivamente, conocidos como indicadores de especies y su cinética de
crecimiento.
Los Lactobacillus presentan
mayor crecimiento poblacional que los Lactococcus,
en la medida
que transcurre el tiempo de exposición en los medios de cultivos. En la Figura
6, se muestra que el crecimiento poblacional de los Lactobacillus se manifiesta en forma exponencial, es decir, el
número de células se incrementa proporcionalmente al aumentar el tiempo de
exposición en el medio nutritivo. El punto máximo de crecimiento se alcanza a
las 72 horas con log 44,79, luego el crecimiento se mantiene constante de 96 a
120 horas. En el caso del crecimiento poblacional de los Lactococcus (Figura 7), el crecimiento poblacional es similar y de
carácter proporcionalmente directo. El crecimiento máximo se alcanza a las 72
horas, pero con valor menor en log 44,65. Estadísticamente la diferencia de
valores entre los Lactobacillus y Lactococcus, corresponde a Log 0,14,
considerado similar. De acuerdo con la comparación de estos resultados con los
obtenidos por Agudelo et al. (2010), ambas cepas (Lactobacillus y Lactococcus), presentan cinética de crecimiento
similar. Igualmente, estos resultados se contrastaron con los presentados por
López (2016) y se determinó que las dos cepas mencionadas, modelan la curva de
crecimiento bacteriano en tres fases: fase de adaptación (inicial), fase
exponencial (ascenso del crecimiento) y fase estacionaria (se detiene el
crecimiento poblacional y se mantiene constante), Figura 6 y 7. El análisis de
la cinética de crecimiento poblacional de Lactobacillus
y Lactococcus, revelan el comportamiento de crecimiento poblacional
favorable para la fermentación láctica y la posibilidad de uso de estos
microorganismos como fermentos iniciadores para mejorar los procesos en la
industria láctea.
§
Antagonismo Cruzado de las Bacterias del Ácido Láctico
La compatibilidad de las bacterias ácido
lácticas, refieren la afinidad fisiológica y bioquímica entre las especies para
la actividad enzimática, por el contrario, la incompatibilidad indica
disimilitud fisiológica y bioquímica de las especies (Ramírez-López y Vélez-Ruíz, 2016). Los resultados obtenidos revelan que
siete pares y un impar de cepas son compatibles fisiológica y bioquímicamente,
pues en la unión de cepas no se formó halos (indicador de compatibilidad en la
prueba de antagonismo cruzado). Las propiedades identificadas son determinantes
en la aplicación de los procesos lácteos, ya que, permiten obtener mixtos o
mezclas de cepas para favorecer la biomasa de microorganismos, por ende,
modificar la velocidad de fermentación láctea y el producto formado con
características específicas de sabor, olor y color en los procesos industriales
en contraste, el resultado obtenido en el par de cepa incompatible,
identificado antagónico, pues se formó halos, permitió reconocer mixtos de
cepas que son inadecuados para utilizar en procesos lácteos .
En lo que se refiere a la prueba del antagonismo cruzado, se presentó
negativa (Cuadro 4). Se determinó al azar la compatibilidad de cepas en las
siguientes muestras: M17 y M24; M8 y M24; M12 y M24; M1 y M24; M8, M1 y M12; M1
y M3; M8 y M3; M24 y M3. De acuerdo con las observaciones microscópicas, los
conjuntos de muestras mencionados presentaron sobrenadantes libres de las
células en los pocillos del medio de cultivo (agar), sin formación de halos, lo
que indica la compatibilidad entre las cepas. Por lo tanto, estos cultivos
mixtos revelan potenciales iniciadores de fermentación láctica con
características variadas. Por el contrario, las cepas M17 y M8 (Figura 8), en
las pruebas del antagonismo cruzado, resultaron positivas, ya que, se
identificó la formación de halos de inhibición en el medio de cultivo (Agar
MRS), lo que indica que no es posible la mezcla de los conjuntos de cepas M17 y
M8, no hay afinidad fisiológica, bioquímica y son antagónicas. La presencia o
ausencia de halos (indicador) en las muestras revelan antagonismo
(incompatibilidad) o afinidad (compatibilidad), respectivamente en las cepas de
bacterias acido lácticas. El comportamiento presencia-ausencia de halos, se
explica por el efecto de la susceptibilidad de las bacterias ácido lácticas a
partir de su exposición a la concentración estandarizada de Agar MRS. Por
comparación, estos resultados son similares a los obtenidos por Ramírez-López y
Vélez-Ruíz (2016), donde muestra el antagonismo cruzado entre las cepas de
bacilos y cocos.
1.
Características genotípicas (moleculares) de las
bacterias del ácido láctico
Las
referencias obtenidas del análisis molecular para la identificación de las
especies de bacterias del ácido láctico (Cuadro 5), indican que la composición
del microbioma de bacterias del ácido láctico se definen en seis especies
identificadas y distribuidas en tres géneros los cuales son: el género Streptococcus (Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus), género Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, y Lactobacillus
delbrueckii) y el género Bifidobacterium
(Bifidobacterium bifidum). El género Streptococcus representa
el 33% de composición de especies, el género Lactobacillus el 50% y el género Bifidobacterium el 17%.
Los
valores indican que la agrupación de Lactobacillus
es la predominante en el microbioma de bacterias del ácido láctico y su
diversidad biológica es más acentuada debido a la mayor cantidad de especies.
La diversidad de especies identificadas en la leche de ganado Jersey coinciden
con los reportados en investigaciones realizadas por Ramírez et al., 2011.
También el género Bifidobacterium, identificado
en la cepa M3, con la especie Bifidobacillus
bifidum, revela la presencia de
especies probióticas en la leche de ganado Jersey. En cuanto a la distribución
de las bacterias de ácido lácticas en los sitios de toma de muestras, los
resultados fueron los siguientes:
Sitio 1: 50% Streptococcus, 25% Lactobacillus, 25%
Bifidobacterium.
Sitio 2: 75% Lactobacillus, 25% Streptococcus.
Sitio 3: 50% Lactobacillus, 50% Streptococcus
Sitio 4: 50% Lactobacillus, 50% Streptococcus
Sitio 5: 25% Lactobacillus, 75% Streptococcus
Sitio 6: 50% Lactobacillus, 50% Streptococcus
El
hallazgo se corresponde con los reportados en las investigaciones realizadas
por Ramírez et al., 2011, donde se identificaron los géneros Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, cepas del grupo de bacterias ácido
lácticas.
La secuenciación DNA de las cepas aisladas puras
M1, M3, M8, M12, M17, M24 representada en los bloques 1, 2, 3, 4, 5 y 6 (Figura
9) refieren la disposición, distribución y diversidad genotípica de cada una de
las especies identificadas, importantes en la diferenciación para el
reconocimiento molecular e identificación de especies de bacterias del ácido
láctico. Los genotipos identificados (Figura 9) se corresponden con los
encontrados en las investigaciones de Cremonesi et al. (2018), los cuales son: Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus,
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii y Bifidobacterium bifidum. Los hallazgos
sobre los genotipos de las bacterias ácido lácticas, han permitido comprender y
descifrar el código genético de estas bacterias, por ende, su identificación,
abordar las posibles formas de comportamientos fisiológicos y bioquímicos
aplicables a los procesos industriales de fermentación láctea y producción de
derivados lácteos. Lo anterior sugiere,
áreas de investigación futura basada en la relación entre los genotipos de las
bacterias ácido lácticas y los procesos de fermentación láctica.
Referente a las limitantes
para el desarrollo de la técnica de secuenciación de DNA, han sido la
disponibilidad de los laboratorios especializados de biología molecular y la
accesibilidad a bancos de datos informáticos disponibles para la comparación de
genotipos de bacterias ácido lácticas.
Conclusiones
· Las formas y
agrupaciones predominantes de bacterias ácido lácticas en la leche de ganado
Jersey, fueron los estreptococos, estreptobacilos y bifidobacilos,
correspondientes a Gram+.
· En la leche de ganado
Jersey se producen dos tipos de actividad enzimática de fermentación,
las cuales son: heteroláctica y homoláctica.
· El crecimiento de bacterias ácido lácticas se
manifiesta en forma exponencial modeladas en la fase de adaptación, fase
exponencial y fase estacionaria, favorables a la fermentación láctica.
· Se manifestó compatibilidad entre las cepas de
bacterias ácido lácticas, lo que revela la potencialidad para producir mixtos
como iniciadores de fermentación láctica.
·
La composición de las bacterias del ácido
láctico que caracteriza la leche de ganado Jersey, es diversa: dos especies
correspondiente al género de Streptococcus,
tres especies pertenecientes al género Lactobacillus
y una especie representada en el género Bifidobacillus.
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a las Fincas del distrito de Tierras Altas, provincia de Chiriquí,
por proporcionar el hato de ganado Jersey para la toma de muestras de leche y
al Instituto de Geociencias de la Universidad de Panamá, por el apoyo con el
SIG y SPSS. Igualmente, a los colaboradores del Centro de Producción e
Investigaciones Agroindustriales (CEPIA) y Universidad Tecnológica de Panamá,
por facilitar los laboratorios para la realización de las pruebas
físicoquímicas y microbiológicas.
También, agradecimiento al laboratorio físicoquímico y microbiológico,
planta térmica de pasteurización, ultrapasteurización y esterilización de la
Empresa Procesadora de lácteos Riba Smith, provincia de Panamá. También
agradecimiento al Laboratorio de Biología Molecular de Microobiomas Foundation,
Colombia.