POLIMORFISMOS
DE NUCLEÓTIDO SIMPLE ASOCIADOS
A CALIDAD DE CARNE EN POBLACIONES CRIOLLO Y TRANSFRONTERIZAS[1]
Axel
Villalobos-Cortés[2]; Ginnette
Rodríguez-Espino[3]; Selma Franco-Schafer[4]
Se determinó el polimorfismo de cinco marcadores SNP asociados a calidad
de carne DGAT1, TG1, MSTN80, MSTN42 y MSTN99 mediante secuenciación NGS. El
polimorfismo del DGAT1, (g.1802265A>G) se encuentra ubicado en el cromosoma
14 del genoma bovino; Tiroglobulina, TG1, (g.9487659A>G) ubicado en el mismo
cromosoma, además tres variantes del gen de Miostatina, MSTN80
(g.6213980A>C), rs110065568; MSTN42 (g.6215942T>C), rs137528458 y MSTN99
(g.6218499A>G), c.938G>A localizados en el cromosoma 2. El análisis de
los SNP se realizó mediante el panel de secuenciación. La preparación de
librerías se realizó siguiendo el flujo de trabajo del fabricante y se
secuenciaron mediante la metodología de amplificación en puente y secuenciación
por síntesis en un equipo MISEQ. Los marcadores que mostraron ser más
informativos fueron DGAT1 y MSTN42, siendo el marcador DGAT1 el que presentó
mayores valores de Hob y He con valores de 0,424 y 0,430, respectivamente y los
valores más bajos para Hob y He se observaron en MSTN42 con 0,322 y 0,328,
respectivamente. Se logró determinar el polimorfismo en los genotipos sometidos
al presente estudio, sin embargo, se observó fijación de alelos de los
marcadores SNP de TG1, MSTN80 y MSTN99 en todos los genotipos. Se reporta por
primera vez el marcador MSTN42 en razas y genotipos criollos y transfronterizos
en Panamá. Los resultados apuntan en la factibilidad de realizar mejoramiento
genético para producción de carne de calidad, particularmente en bovinos
criollos Guaymí y Guabalá. Se requiere incrementar las poblaciones para mejorar
la precisión de los marcadores utilizados en el presente estudio.
Palabras
clave: Bioinformática, biotecnología, ganadería, genoma,
marmoleado.
EVALUATION OF SNP MARKERS ASSOCIATED WITH
QUALITY OF MEAT IN CREOLE AND CROSS-BORDER POPULATIONS
ABSTRACT
The polymorphism of
five SNP markers associated with meat quality, DGAT1, TG1, MSTN80, MSTN42, and
MSTN99, was determined by NGS sequencing. The polymorphism of DGAT1
(g.1802265A>G) is located on chromosome 14 of the bovine genome;
Thyroglobulin, TG1, (g.9487659A>G) located on the same chromosome, and three
variants of the Myostatin gene, MSTN80 (g.6213980A>C), rs110065568; MSTN42
(g.6215942T>C), rs137528458, and MSTN99 (g.6218499A>G), c.938G>A located
on chromosome 2. SNP analysis was performed using the sequencing panel. Library
preparation was carried out following the manufacturer's workflow and sequenced
using bridge amplification and sequencing by synthesis on a MISEQ system. The
most informative markers were DGAT1 and MSTN42, with DGAT1 showing the highest
Hob and He values of 0.424 and 0.430 respectively, and the lowest Hob and He
values observed in MSTN42 with 0.322 and 0.328 respectively. Polymorphism was
determined in the genotypes subjected to this study; however, fixation of TG1,
MSTN80, and MSTN99 SNP alleles was observed in all genotypes. The MSTN42 marker
is reported for the first time in native and cross-border breeds and genotypes
in Panama. The results suggest the feasibility of genetic improvement for
quality meat production, particularly in Guaymí and Guabalá native cattle.
Increasing populations is required to improve the precision of the markers used
in this study.
Keywords: Bioinformatics,
biotechnology, molecular markers, meat quality, livestock.
INTRODUCCIÓN
La secuenciación de alto rendimiento y la
bioinformática ha hecho que el uso de polimorfismo de nucleótido simple (SNP)
sea progresivamente más popular (Heaton et al., 2002). Estos marcadores se
encuentran distribuidos por todo el genoma y pueden localizarse tanto en
regiones codificantes como no codificantes (Sachidanandam et al., 2001). La
diversidad de distintos SNP permite estimar la estructura de la raza de
animales individualmente, utilizando datos genómicos (Frkonja et al., 2012;
Hulsegge et al., 2013). El contenido de grasa en la producción de carne
requiere atención debido a que al mejorar la relación de deposición magra a
grasa implica mejor eficiencia en la conversión de alimentos, disminución en el
costo de la cría y menor presión sobre los abastecimientos mundiales de
alimento (Sillence, 2004). El marmoleado es muy importante, ya que está
correlacionado con la grasa intramuscular, lo que se relaciona con los hábitos
del consumidor y el establecimiento de precios de la carne (Killinger et al.,
2004).
Varios trabajos de
asociación afirman que el gen del diacilglicerol O-aciltransferasa 1 (DGTA1) es
marcador de los rasgos de deposición de grasa (Kühn et al., 2004; Tantia et
al., 2006). Este gen se asocia con incremento en la concentración de ácidos grasos
en leche y perfil de ácidos grasos insaturados en bovinos y caprinos, así como
el marmoleo en ganado de carne, principalmente
en Bos taurus (Demeter et al., 2009; Armstrong et al., 2011). El gen
DGAT1, K232A (rs109234250) genera dos variantes alélicas alelo A alanina en
ubicación 232 del polipéptido y alelo K, lisina en la misma posición (Armstrong
et al., 2011).
Los datos reportados para el gen DGAT1 muestran que
existe predominancia de alelos y genotipos asociados con bajo porcentaje de
grasa y concuerdan con lo hallado en razas criollas como el Criollo Uruguayo
puro (Rincón et al., 2006). En razas de Bos taurus es usual esta
tendencia, a diferencia de lo que ocurre en razas Bos indicus y
genotipos lecheros y de carne seleccionados para un mayor contenido graso en la
leche, como el Jersey, (Kaupe et al., 2004; Casas et al., 2005; Gill et al.,
2009).
El gen TG codifica la hormona tiroglobulina,
la precursora de triyodotironina y tetrayodotironina, involucrada en el
desarrollo de células grasas (Ailhaud et al., 1992; Darimont et al., 1993). También está relacionada con los niveles de
deposición de grasa intramuscular. Este gen presenta un SNP en un elemento
repetitivo arriba del promotor que ha sido asociado a variaciones en los
niveles del veteado de la carne en ganado vacuno y se incluye en pruebas
comerciales de ADN. Debido a que las yodotironinas afectan los
adipocitos y los niveles de la hormona tiroidea influyendo en la proporción de
grasa de la leche, se espera que el espesor de la grasa subcutánea y el
porcentaje de grasa se vean influenciados por los polimorfismos de TG (Folley y Malpress, 1948).
La
miostatina (MSTN), también conocida como factor de crecimiento y
diferenciación 8 (GDF8), es uno de los principales reguladores del desarrollo
del músculo esquelético (Beyer et al., 2013). Es un
gen altamente conservado en mamíferos, y actúa reduciendo el tamaño muscular.
Los animales con esta deficiencia muestran un aumento en la masa del músculo
esquelético conocido como doble musculatura (mh). Se han descrito mutaciones en
MSTN en numerosas especies, particularmente en bovinos (Grobet et al., 1997)
como la variante MYO_C313Y, reportada en razas como la Gasconne, Piedmontese y
Parthenaise (McClure and McClure, 2016;
Bongiorni et al., 2016; Aiello et al., 2018). Algunas variantes se
utilizan actualmente como método de selección genómica como la variante p. Phe94L
(F94L) en la raza Limousine, particularmente en peso al nacimiento, facilidad
de parto, peso al destete (Lee et al., 2019).
El objetivo de este trabajo es estimar la
frecuencia alélica y genotípica de cinco polimorfismos de nucleótido simple asociados a calidad
de carne, DGAT1, TG1, MSTN80, MSTN42 y MSTN99 en algunos genotipos criollos y
transfronterizos mediante secuenciación NGS.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se
determinó el polimorfismo de cinco
marcadores SNP asociados a calidad de carne DGAT1, TG1, MSTN80, MSTN42 y MSTN99 mediante secuenciación NGS. El
polimorfismo del diacilglicerol
aciltransferasa 1, DGAT1, (g.1802265A>G) se encuentra ubicado en el
cromosoma 14 del genoma bovino; Tiroglobulina, TG1, (g. 9487659A>G) ubicado en el mismo cromosoma, además tres variantes del gen de Miostatina, MSTN80 (g.6213980A>C), rs110065568; MSTN42 (g.6215942T>C), rs137528458 y MSTN99 (g.6218499G>A), c.938G>A localizados en el cromosoma 2.
Se tomaron muestras aleatorias de 73 animales
de diversos genotipos puros, Criollos
Guaymí (GUY) y Guabalá (GUA), transfronterizos Brahman (BRAH), Holstein (HO) y
Senepol (SEN) y cruzados (europeo x cebú (EXC) e Indefinidos (SRD). Se
obtuvieron muestras de sangre en finca de productores colaboradores y en fincas
ganaderas del IDIAP, utilizando tubos con EDTA de 5 ml.
La extracción de ADN
se llevó a cabo mediante mini columnas por centrifugación utilizando un kit
comercial; el rendimiento de ADN obtenido fue no menor a 50 ng, medido a través
de un cuantificador fluorométrico.
El análisis de los
SNP se realizó mediante el panel reducido de secuenciación Truseq Bovine
Parentage, obtenido a partir de un chip de ADN, BovineSNP50 (Matukumalli
et al., 2009). La preparación de librerías se realizó siguiendo el flujo de
trabajo del fabricante. Una vez amplificadas y normalizadas las librerías, se
verificó la calidad mediante un analizador de fragmentos, resultando en un
tamaño esperado de entre 200 y 300 bp. Luego se procedió a secuenciarlas
utilizando la metodología de amplificación en puente y secuenciación por
síntesis en un equipo MISEQ™. Los datos fueron exportados al programa Sequence
Genotyper para su procesamiento y análisis. Para evaluar la variabilidad
genética dentro de cada población, se calcularon los siguientes parámetros:
Equilibrio Hardy-Weinberg, Frecuencia alélica y genotípica, heterocigosis
observada (Hob) y esperada (He) e Índice de Shannon mediante el programa
Genetix v. 4.02 y Genalex 6.5 (Belkhir et al., 2004; Peakall y Smouse, 2012).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los marcadores TG1,
MSTN80 y MSTN99 resultaron monomórficos dentro de este estudio. Los marcadores
que mostraron ser más informativos fueron DGAT1 y MSTN42, siendo el marcador
DGAT1 el que presentó mayores valores de Hob y He con valores de 0,424 y 0,430
respectivamente y los valores más bajos para Hob y He se observaron en MSTN42
con 0,322 y 0,328 respectivamente, como se muestra en el Cuadro 1. Estos
valores de diversidad son relevantes debido a que permite una estimación de la
capacidad de resiliencia de las especies a las variaciones climáticas (Notter,
1999). Los resultados de Hob y He del gen
DGAT1 fueron ligeramente mayores respecto a razas criollas de la región de
Rocha de Uruguay con Hob=0,416 y He=0,391 y Cerro Largo, Hob=0,211 y He=0,193
(Armstrong et al., 2011) en un estudio orientado al mejoramiento genético de la
carne bovina.
La media general del índice de
Shannon en todos los marcadores fue (I=0,218), mayor a lo reportado por Pashaei
et al. (2009) en la raza Holstein (I=0,110) y la raza nativa Mazarandanian de
Pakistán (0,210). Según la prueba de Chi-cuadrado, las frecuencias genotípicas
de DGAT1 y MSTN42 están fuera del desequilibrio de Hardy Weinberg (p>0,05),
indicando que la presión de selección en ambos marcadores es baja.
En el cuanto a
los valores de diversidad en relación a los genotipos, la Guabalá, presentó los
dos marcadores con valores más altos DGAT1 (Hob =0,412; He=0,438) y MSTN42
(Hob=0,50; He=0,375), seguidos de la Holstein, DGAT1 (Hob =0,600; He=0,420) y
MSTN42 (Hob =0,400; He=0,320) la raza Senepol, DGAT1 (Hob =0,600; He=0,420),
MSTN42 (Hob =0,200; He=0,420) y Guaymí (Hob =0,412; He=0,438), MSTN42 (Hob
=0,471; He=0,484). La raza Brahman presentó los valores más bajos de DGTA1 (Hob
=0,067; He=0,180) y MSTN42 (Hob =0,133; He=0,124) lo que podría ser atribuida a
las diferencias entre las especies ya que las razas taurinas presentan mejores
parámetros de calidad de carne que las cebuinas (Ramírez-Barboza et al., 2016).
No se observó polimorfismo en ninguno de los genotipos para el TG1 con 100% de
presencia del SNP de referencia G, sin embargo, se han reportado polimorfismos
en ganado criollo uruguayo con la finalidad de desarrollar programas de
mejoramiento genético en carne (Armstrong et al., 2011). Tampoco se observó en
MSTN80 presentando el 100% de la frecuencia alélica de C y MSTN99 con 100% de
frecuencia de alelo G, calificados como monomórficos en este estudio.
Polimorfismos de la variante MSTN80 fue reportada por Grobet et al. (1997) y
Lee et al. (2019) como una sustitución conservadora de fenilalanina a leucina
en la posición de aminoácido 94 en el primer exón, debido a una transversión
C>A en la posición de nucleótido 282 del gen de miostatina (c.282C>A),
en las razas Angus y Limousine. Además, Kambadur et al. (1997) y Libor
(2008) reportaron la variante MSTN99 como una transición G>A en el
nucleótido 938, en el
cromosoma 2 en la raza Piamontesa y Gascona europeas.
Se observó que las frecuencias más altas son la del alelo A de
DGAT1, con 0,548 y C de MSTN42 con 0,740 (Ver Figura).
Las
frecuencias genotípicas globales por marcador fueron, para DGAT1, AA=0,300,
AG=0,495 y GG=0,204 y MSTN42 TT=0,068, TC=0,385 y CC=0,547 (Cuadro 2).
El genotipo con mayor frecuencia de alelo A
(alterno) en DGTA1 fue BRAH A = 0,900 y para G (alelo de referencia) las
mayores fueron la HO y SEN con G = 0,700 y de manera recíproca fueron los
valores más bajos para los alelos correspondientes. En el caso de MSTN42, la
raza Brahman presentó la frecuencia más alta del alelo de referencia, C=0,933
seguido de la Holstein con C=0,800. Por otro lado, la raza Senepol presentó la
frecuencia más alta del alelo alterno T=0,700. Sin encontrar reportes de este
marcador en referencias consultadas hasta el momento. Sin embargo, datos de
frecuencia alélica se han reportado mediante el proyecto NextGen: IRBT, en la
Vaca Bos taurus iraní, que presentan valores similares (C=0,812 y
T=0,188) a la vaca Holstein y los cruces EXC y SRD reportados en este trabajo
(ensembl.org, 2018).
Estos
resultados apuntan que los marcadores polimórficos encontrados pueden ser de
utilidad en los programas de mejoramiento sumando a la selección cuantitativa,
sin embargo, se requiere un mayor análisis, incrementando el número de animales
y razas.
CONCLUSIONES
·
Se logró determinar el polimorfismo en los
marcadores DGAT1, MSTN42 en los genotipos sometidos al presente estudio, sin
embargo, se observó fijación de alelos de los marcadores SNP de TG1, MSTN80 Y
MSTN99 en todos los genotipos.
·
Se reporta por primera vez el marcador MSTN42
en razas y genotipos criollos y transfronterizos en Panamá.
·
Los resultados apuntan en la factibilidad de
realizar mejoramiento genético para producción de carne de calidad,
particularmente en bovinos criollos Guaymí y Guabalá.
·
Se requiere incrementar las poblaciones con la
finalidad de mejorar la precisión y resolución de los marcadores utilizados en
el presente estudio.
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AGRADECIMIENTOS
Al
Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá (IDIAP), la Secretaría Nacional
de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), al igual que al Sistema Nacional
de Investigación (SNI), por el financiamiento del presente trabajo.