PREVALENCIA DE HEMOPARÁSITOS EN TERNEROS DE DOBLE PROPÓSITO DE LA REGIÓN
CENTRAL DE PANAMÁ[1]
Rita González-Herrera[2]; Marcelino Jaén-Torrijos[3]; Selma Franco- Schafer[4]
RESUMEN
Con el objetivo de conocer la prevalencia y dinámica de infección de Babesia
bigemina, Babesia bovis y Anaplasma marginale, se
recolectaron muestras de sangre a 11 terneros desde recién nacidos hasta el
destete, en dos fincas de doble propósito del arco seco de Panamá. Las muestras
analizadas por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), mediante cebadores
específicos, correspondían a los 3, 5 y 7 meses de edad de los terneros. El
hemoparásito con mayor presencia en las muestras estudiadas fue A. marginale,
seguido de B. bigemina y B. bovis con 31/33, 24/33 y 4/33
muestras positivas para la Finca El Ejido; y con 30/33, 15/33 y 7/33 muestras
positivas para la Finca El Jaguito, respectivamente. La implementación de
protocolos de biología molecular permitió la detección de bovinos portadores de
hemoparásitos, lo cual es clave para establecer medidas de control eficaces y
oportunas en las fincas estudiadas.
Palabras
clave: Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia bovis, identificación
molecular, PCR.
PREVALENCE OF HEMOPARASITES IN CALVES FROM DUAL
PURPOSE FARMS IN THE CENTRAL REGION OF PANAMA
ABSTRACT
To determine the prevalence and dynamics of Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma
marginale infection, blood samples were collected from 11 calves from
newborn to weaning on two dual-purpose farms in the Dry Arch of Panama. The
samples analyzed by Polymerase Chain Reaction (PCR), using specific primers,
corresponded to calves at 3, 5 and 7 months of age. The hemoparasite with the
highest presence in the samples studied was A.
marginale, followed by B. bigemina
and B. bovis with 31/33, 24/33 and
4/33 positive samples for the El Ejido Farm; and with 30/33, 15/33 and 7/33
positive samples for the El Jagüito Farm, respectively. The implementation of
molecular biology protocols allowed the detection of cattle carrying
hemoparasites, which is key to establish more effective and timely control
measures on the farms studied.
Keywords: Anaplasma marginale, Babesia bigemina, Babesia
bovis, molecular identification, PCR.
INTRODUCCIÓN
En las regiones tropicales y subtropicales del
mundo las enfermedades hemoparasitarias como anaplasmosis y babesiosis bovina,
tienen como principal vector a la garrapata del bovino Rhipicephalus
microplus (Parola & Raoult, 2001; Ravindran et al., 2006), aunque se ha demostrado que la anaplasmosis también es trasmitida por
otros géneros de garrapatas como Dermacentor e Ixodes (Kocan et al., 2004; Estrada-Peña et al., 2022) y
mecánicamente por picadura de moscas o fómites contaminados con sangre (Kocan et al., 2003; Bock, et al., 2006; Reinbold et al.,
2010).
La babesiosis bovina es una enfermedad parasitaria
febril causada por los protozoarios intracelulares Babesia bovis y Babesia
bigemina, los cuales producen lisis eritrocítica extensiva lo que conlleva
a anemia, hemoglobinuria y riesgo de muerte del
bovino (Bock et al., 2004). La anaplasmosis
bovina en América es causada por Anaplasma marginale, una rickettsia que
parasita los eritrocitos produciendo enfermedad hemolítica de leve a severa,
incluyendo signos como anemia, ictericia y abortos en bovinos (Bock et
al., 2006; Aubry & Geale, 2011).
Las enfermedades
hemoparasitarias representan un desafío para la industria láctea y de carne, ya
que causan pérdidas en términos de morbilidad, mortalidad, pérdidas de
producción, costo de servicios veterinarios y costo de tratamiento (Brown, 1997; Grisi et al., 2002).
El diagnóstico tradicional de hemoparásitos en
bovinos requiere establecer la condición clínica de los animales y contrastarla
con el grado de parasitemia y el nivel de hematocrito (Benavides
Ortíz et al., 2012). Para el diagnóstico rutinario directo, se realiza
la observación microscópica de frotis de sangre capilar teñidos con Giemsa.
Este tipo de diagnóstico en animales persistentemente infectados es difícil y
muchas veces errático, debido a la baja tasa de eritrocitos infectados en
sangre periférica (Figueroa et al., 1992). Por
ese motivo, la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) surge como
una alternativa diagnóstica con mayor sensibilidad, especificidad y ahorro de
tiempo que las técnicas tradicionales (Figueroa et
al., 1993; Bock et al., 2004).
En Panamá se han realizado investigaciones previas
sobre la transmisión de B. bovis y A. marginale en bovinos
mediante la evaluación de anticuerpos IgG, y se encontró una prevalencia por
encima del 80% para ambos parásitos (Jaén, 2007;
2009). Sin embargo, existen pocos estudios que evidencien la presencia
de B. bigemina en bovinos. Con lo anterior expuesto, el objetivo de este
trabajo fue conocer la prevalencia de Babesia bigemina, Babesia bovis,
y Anaplasma marginale, en dos fincas del sistema doble propósito de
Coclé y Los Santos, en terneros de 3 a 7 meses de edad, mediante herramientas
moleculares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tipo, zona y población de
estudio
Se realizó estudio
descriptivo de cohorte longitudinal. Se seleccionaron dos fincas del sistema
doble propósito de las localidades del Ejido en Los Santos (Instituto de
Innovación Agropecuaria de Panamá [IDIAP]) y en el Jaguito de Aguadulce
(productor). Ambas fincas pertenecen a la zona 1 del arco seco de Panamá, que
se caracteriza por tener una precipitación anual de aproximadamente 1,500 mm, una altura de 1,100
msnm y los suelos son del tipo aluvión de costa (Ministerio
de Desarrollo Agropecuario [MIDA] 2024a)
Durante el periodo de abril del 2015 a mayo del
2016 se escogieron de cada finca 11 terneros (Bos taurus x Bos
indicus) machos y hembras, los cuales fueron muestreados desde el
nacimiento cada 30 días hasta el destete. Los bovinos estuvieron naturalmente
expuestos a la infestación por garrapatas, bajo las prácticas de manejo
específicas de cada finca. Para este estudio se analizaron las muestras
correspondientes a las edades de 3, 5 y 7 meses, para un total de 33 muestras
por finca.
Toma de muestra
En cada finca se obtuvo muestras de sangre completa
de la vena yugular de los terneros. Las muestras fueron colectadas en tubos con
EDTA de 3 ml y transportadas refrigeradas al Laboratorio de Salud Animal del
IDIAP en Divisa. En el laboratorio las muestras de sangre se refrigeraron hasta
su procesamiento.
Detección por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La técnica de PCR ha demostrado ser una herramienta
rápida, reproducible y con una alta sensibilidad y especificidad para el
diagnóstico de hemoparásitos. En el presente trabajo, se validó una metodología
que permite identificar la infección aguda o persistente mediante la detección
directa del ADN de dichos parásitos. A continuación, se describe la
metodología. El aislamiento de ADN de cada muestra se realizó con el kit
comercial Wizard® Genomic DNA Purification, siguiendo las recomendaciones del
fabricante. La calidad y cantidad de ADN se verifico mediante
espectrofotometría. Para la identificación de B. bigemina, B. bovis
y A. marginale se utilizaron los cebadores específicos BiIA/BiIB,
BoF/BoR y 1773F/2957R, respectivamente. Las referencias de los cebadores se
describen en el Cuadro 1. Para las
reacciones de PCR se utilizó el kit comercial Taq PCR Master Mix, el cual
contiene 2,5 unidades de Taq polimerasa, 1,5 mM de MgCl₂, 1X de búfer de Taq y 200 µM de cada desoxinucleótido en un solo
mix. Se adicionó 0,5 µM de cada
iniciador y 100 ng de ADN de cada muestra en un volumen final de 25 µl.
El programa de amplificación fue igual para los
tres parásitos y consistió en una desnaturalización inicial de 5 minutos a 95°
C, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95° C por 1 minuto, anillamiento
a 58° C por 1 minuto y extensión a 72° C por 1 minuto. Adicional un ciclo de
extensión final por 10 minutos a 72° C.
Las reacciones se repitieron dos veces para cada
muestra y cada cebador. Para controles positivos se utilizaron muestras de
animales con síntomas clínicos y confirmados positivos a hemoparásitos mediante
evaluación microscópica de frotis sanguíneo. Como control negativo se utilizó
agua ultrapura.
Los productos obtenidos de la PCR fueron analizados
mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% teñidos con SYBR Safe y
visualizados con un sistema de documentación de geles. El tamaño de los
productos de PCR fue estimado mediante un marcador de peso molecular de 100
pares de base.
Prevalencia
Con los registros por muestreo de positivos y
negativos obtenidos en la prueba de PCR para B. bigemina, B. bovis
y A. marginale, se calculó la prevalencia mensual de cada parásito en
cada finca; definida la prevalencia como la proporción de bovinos positivos
sobre el total de bovinos analizados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la finca El Ejido, el hemoparásito con mayor
presencia en las muestras analizadas fue A. marginale (93,9 %; 31/33),
seguido de B. bigemina (72,7%; 24/33) y B. bovis (12,1%; 4/33).
Se encontró que el 12% (4/33) de las muestras analizadas presentaron una triple
infección con B. bigemina + B. bovis + A, marginale;
un 61% (20/33) mostraron coinfección de B. bigemina + A. marginale;
un 21% (7/33) tuvo infección individual de A. marginale y un 6% (2/33)
de las muestras resultaron negativas a los tres hemoparásitos. Es importante
indicar que en el Ejido se han presentado casos clínicos esporádicos de estas
enfermedades y con este estudio se confirma la presencia de estos parásitos.
La infección de Babesia bigemina se observó
de la siguiente manera: para la finca El Ejido, la prevalencia más alta se
ubicó en el mes 7 (81,8%; 9/11) y la más baja en el mes 5 (63,6%; 7/11). Para
la finca el Jaguito, en los meses 5 y 7 se encontraron las prevalencias más
altas (54,55%; 6/11) y en el mes 3 la prevalencia más baja (27,3%; 3/11)
(Figura 1). El promedio de muestras positivas a B. bigemina para la
finca El Ejido fue de 72,5% y para El Jaguito de 45,5%; y la prevalencia
general de este parásito en el estudio fue de 58,9%.
En la Finca El Jaguito, el hemoparásito con mayor
frecuencia fue A. marginale (90,9%; 30/33), seguido de B. bigemina
(45,4%;15/33) y B. bovis (21,2%;7/33). Se observó que el 9% (3/33) de
las muestras analizadas presentaron una triple infección de B. bigemina
+ B. bovis + A. marginale; en un 33% (11/33) se observó
coinfección de B. bigemina + A. marginale y en un 12% (4/33)
coinfección de B. bovis + A. marginale. Del total de muestras en
esta finca, 36% (12/33) y 3% (1/33) mostraron infección individual para A.
marginale y B. bigemina, respectivamente; y un 6% (2/33) resultaron
negativas a los tres hemoparásitos.
En cuanto a la infección de Babesia bovis,
para la finca El Ejido la prevalencia más alta se observó en el mes 3 (27,3%;
3/11) y la más baja en el mes 5 (0%). En la finca El Jaguito, la prevalencia
más elevada se ubicó en el mes 3 (27,3%; 3/11); y en los meses 5 y 7 se
encontraron las prevalencias más bajas (18,2%; 2/11) (Figura 2). El promedio de
muestras positivas a B. bovis para la finca el Ejido fue de 12,1% y para
El Jaguito de 21,2%; y la prevalencia general de este parásito en el estudio
fue de 16,6%.
Respecto a la infección de Anaplasma marginale,
en el mes 3 se observó un 81,8% (9/11) y 72,7% (8/11) de prevalencia para la
Finca El Ejido y Jaguito respectivamente; y en los meses 5 y 7 se encontró la
totalidad de los terneros positivos (100%; 11/11) en ambas fincas (Figura 3).
El promedio de muestras positivas a A. marginale para la finca El Ejido
fue de 93,9% y para El Jaguito de 90,9%; y la prevalencia general de este
parásito en el estudio fue de 92,4%.
Anaplasma marginale se trasmite biológicamente por diferentes especies de garrapatas (Kocan et al., 2004) y se ha demostrado la transmisión
transestadial, donde las garrapatas secretan formas infecciosas de la
rickettsia en su saliva mientras se alimentan (Ueti et al., 2007). Hay estudios
que también demuestran la transmisión transovárica de la rickettsia (Amaro
Estrada et al., 2020). A. marginale se transmite además por insectos
hematófagos como los Tabanus, los cuales están presentes en
Panamá (Smithsonian Tropical Research Institute
[STRI], 2024); y también se da la transmisión mecánica mediante el uso
de material e instrumental utilizado en las prácticas de manejo sanitario que
contengan sangre contaminada y que no hayan sido desinfectados apropiadamente
entre animales (Aubry & Geale, 2011). Por lo anterior, A.
marginale es reportado con mayor frecuencia que las babesias y estos
resultados son similares a lo que ha encontrado en países como Brasil (Costa et al., 2018), Ecuador (Medina-Naranjo et al., 2017) y Colombia (Herrera et al.,
2008).
En Panamá, Jaén (2009), reportó en un estudio
de tipo prospectivo en seis fincas de leche de
las provincias de Herrera y Los Santos, entre los años 2006 – 2007 y mediante
serología, una alta incidencia (80%) de Anaplasma marginale en 631
muestras de suero a la edad del destete de los terneros (210 días),
independientemente del sistema de producción al cual pertenecían los bovinos,
con lo cual se corrobora la presencia de esta rickettsia en bovinos del país.
Reportes de casos clínicos de anaplasmosis y
babesiosis bovina son confirmados en forma rutinaria por pruebas de tinción de
frotis sanguíneos por los Laboratorios de Diagnóstico del Ministerio de
Desarrollo Agropecuario (MIDA). Según el boletín epidemiológico, para
anaplasmosis bovina se reportaron 14/20 muestras positivas (70%) en las
provincias de Panamá y Chiriquí en el año 2019; 2/2 muestras positivas (100%)
en la provincia de Panamá en el año 2020 y 1/3 muestra positiva (33%) en
Chiriquí para el año 2022 (MIDA, 2024b).
Rhipicephalus microplus es el vector principal de B. bigemina y B. bovis, sin
embargo, otras especies de garrapatas también pueden ser transmisoras (Organización Mundial de Sanidad Animal [OMSA], 2021). La
infección por babesias se produce cuando en las etapas de ninfa y adulta (en el
caso de B. bigemina) y larvaria (en el caso de B. bovis), las
garrapatas se alimentan del hospedador (bovino) (Smith,
1978). Las babesias luego se transmiten a los ovarios de las garrapatas
y, por lo tanto, las larvas emergentes son portadoras de la infección (Claudio
S. L. & Rafael, 2008). Sin embargo, la capacidad de B. bigemina de permanecer a través
de generaciones de garrapatas en ausencia de reinfección, lo cual no es una
característica de B. bovis, generalmente resulta en una mayor
positividad de B. bigemina en comparación con B. bovis (Ríos-Tobón et al., 2014) y
esto concuerda con lo encontrado en el presente estudio.
Estudios serológicos en Panamá han demostrado la
presencia de anticuerpos (IgG) contra Babesia bovis en bovinos. En un
estudio realizado en bovinos de fincas de Leche de área de Capira, en la
provincia de Panamá Oeste, se reportó una prevalencia general de 84,9 % para Babesia
bovis en 252 muestras entre los años 1995 – 1996 (Jaén,
2007). La presencia de B. bovis también fue reportada para esos
mismos años en la región de Arenas, provincia de Veraguas, en un estudio
prospectivo, donde se encontró en 10 terneros de la raza Brahman, una
incidencia del 80% del parásito a los 360 días de edad, y se concluyó que
existía una buena inoculación de B. bovis en campo por la garrapata R.
microplus (Jaén et al., 2009).
Según el boletín epidemiológico del MIDA en el año
2019, para babesiosis bovina se encontraron 2/61 muestras positivas (3%) en la
provincia de Panamá, siendo éste el último reporte para babesiosis en los
últimos 5 años en el país, según (MIDA, 2024b).
Debido a sus similitudes morfológicas no siempre es
posible distinguir a B. bovis de B. bigemina, con lo cual la PCR
ha demostrado ser de utilidad para la detección de babesias en bovinos
portadores debido a su alta sensibilidad y especificidad en comparación con la
observación microscópica de frotis de sangre (Awad et
al., 2011; Mosqueda et al., 2012; Oliveira et al., 2008).
En Panamá, el diagnostico
de hemoparásitos se basa en técnicas parasitológicas y poco se ha investigado
sobre la epidemiología de estas enfermedades. En áreas donde las garrapatas son
endémicas, los bovinos desarrollan inmunidad a las infecciones por
hemoparásitos luego del primer contacto y se mantienen como portadores sanos.
Sin embargo, pueden ocurrir brotes de las enfermedades si se interrumpe la
exposición de los animales jóvenes a las garrapatas y/o si se introducen
garrapatas infectadas con babesias y anaplasma en áreas previamente libres de
garrapatas (Aubry & Geale, 2011; OMSA, 2021).
La epidemiología de estas enfermedades se ha
estudiado tradicionalmente mediante la identificación de anticuerpos IgG en
bovinos de 3 a 9 meses de edad, y el cálculo de tasa de inoculación. Sin embargo,
existen otros factores tales como una inmunidad pasiva insatisfactoria, estrés,
estado nutricional, época del año, manejo, tipo de pasto o altas tasas de
infestación de pastos y ganado por el vector, que son importantes para
comprender el comportamiento de los hemoparásitos y la clasificación de un
estado como enzoóticamente estable o inestable (Amorim
et al., 2014).
Es conocido que el uso de acaricidas altera la
prevalencia de hemoparásitos, ya que la presencia permanente de garrapatas
durante todo el año, permite en las fincas la inoculación continua de los
patógenos en los bovinos desde el momento de su nacimiento; sin embargo, en
este estudio no se realizó una medida de la frecuencia de baños garrapaticidas
y tampoco se midió la carga de garrapatas en las fincas estudiadas, lo que
hubiese permitido inferir sobre los factores que inciden en la presencia de Babesia spp. y Anaplasma marginale
en estas dos fincas.
Este trabajo es el primer estudio en el que se
utilizó la técnica de PCR para detectar la presencia de hemoparásitos en
bovinos en Panamá. Sin embargo, existen reportes de trabajos donde se
identifican molecularmente hemoparásitos en garrapatas. En el 2022, en una
tesis de maestría, se encontró un 18,3% (15/82) de muestras de ADN de
garrapatas positivas a Anaplasma marginale, y 0% para B. bovis y B.
bigemina, en seis fincas ubicadas en las provincias de Chiriquí, Veraguas,
Los Santos, Ngäbe-Buglé, Bocas del Toro y Panamá (Bernal
López, 2022). En 2024, Bermúdez C et al.
detectaron ADN de especies de Anaplasmataceae (Ehrlichia minasensis y
A. marginale) en 21% (3/14) hembras de R. microplus que fueron
recolectadas en una vaca en la provincia de Chiriquí.
EL diagnóstico de hemoparásitos en Panamá se
realiza en campo, generalmente de manera clínica; no hay programas de control
basados en estudios de inmunidad de las fincas, ni manejo integral de la
garrapata ni vacunas; por lo tanto, es importante continuar con estudios
epidemiológicos que permitan identificar las zonas en riesgo de ocurrencia de
brotes y el impacto económico de estas enfermedades en la producción ganadera.
CONCLUSIONES
·
La técnica de PCR permitió el diagnóstico de Babesia bigemina, B.
bovis y A. marginale en bovinos
aparentemente sanos, demostrando ser una herramienta útil y
replicable para estudios posteriores. El análisis bioinformático de
productos de PCR permite caracterizar los genes de los parásitos, facilitando
la identificación del potencial inmunogénico, lo cual es clave para la búsqueda
de nuevas estrategias de control de los hemoparásitos. El siguiente objetivo de
nuestras investigaciones consiste en la caracterización molecular de los
parásitos de distintas áreas geográficas, para diferenciar cepas panameñas de
las extranjeras, diferenciar fenotipos locales de patogenicidad, identificar
haplotipos y ocurrencias de coinfección.
·
En ambas fincas se detectó la presencia de los tres hemoparásitos,
siendo A. marginale el más prevalente, seguido de B. bigemina y B.
bovis, mostrando la necesidad de realizar más investigaciones
epidemiológicas en otras regiones del país, con el fin de determinar los
niveles de estabilidad enzoótica que existen en los sistemas ganaderos y el
riesgo de desarrollar brotes de las enfermedades.
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