AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIÓN DE LA MICOBIOTA DE SUELOS DEDICADOS AL CULTIVO DE TOMATE EN
AZUERO[1]
Maryuri Estrada[2]; Julio Rachell[3]; Rito Herrera[4]; Lisbeth L. Rodríguez[5]; Dalila Montañez[6]; Gesabel Navarro[7]; Álex Martínez[8]
RESUMEN
Palabras clave: Alternativa ecológica, Aspergillus, hongos antagonistas, Penicillium, Trichoderma.
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF MYCOBIOTA FROM SOILS DEDICATED TO TOMATO
CULTIVATION IN AZUERO
ABSTRACT
Antagonist fungi represent an ecological
alternative to the use of agrochemicals to control phytopathogenic
microorganisms that affect crops. This work was carried out during 2016 and
2017 with the purpose of finding fungi of the genus Trichoderma and
knowing the diversity of fungi present in soils dedicated to the cultivation of
tomatoes (Solanum lycopersicum). Eight study sites located in the Azuero
Peninsula were selected. In total, 200 soil samples were collected (25 per
site) and serial dilutions were carried out for isolation. Thus, a total of 590
fungi were isolated, thus generating around 576 inclined fungi (morphotypes).
The identification was carried out at the genus level, and at the
morphospecies, for fungi that only produced vegetative structure. The data were
statistically analyzed using Pearson's correlation coefficient. On the other
hand, 340 fungal growths were isolated in small Petri dishes, grouped into 15
genera. 75% of the isolates were identified at the gender level; 2% were
yeasts; 23% were sterile mycelium. The most frequent genera were: Aspergillus
and Penicillium. In addition, biochemical tests of microbial respiration
and enzymatic activity of dehydrogenase were carried out in the soils of the
four farms of greatest agricultural importance, where it was determined that
the soil that presented the highest microbial activity xi (CO2
production) was that of La Colorada, followed by El Faldar and Tonosí; the one
that presented the lowest microbial activity was Tonosí Centro. With the
calculation of the CFU it was possible to determine that the optimal fungal
load is found in the 10-4 dilution.
Keywords: Antagonistic fungi, Aspergillus, ecological
alternative, Penicillium,
Trichoderma.
INTRODUCCIÓN
Los hongos presentes en el suelo representan
la micobiota edáfica, estos ocupan el mayor porcentaje de biomasa microbiana de
dicho recurso. Además, desempeñan una serie de funciones claves para el
funcionamiento de los ecosistemas, tales como la descomposición orgánica de la
materia y el ciclaje de nutrientes. Estos procesos son esenciales para los
suelos agrícolas, ya que si existe una diversidad de hongos benéficos que
aumentan la productividad y el rendimiento de los cultivos (Landínez-Torres y
Fagua, 2022).
Tradicionalmente, para el control de
organismos fitopatógenos se utilizan los agroquímicos, sin embargo, el uso de
hongos en la agricultura representa una alternativa de biocontrol eficiente
ante los patógenos presentes en los suelos agrícolas, a la vez que se disminuye
el uso de compuestos sintéticos y con esto los efectos negativos que ocasionan
en el ambiente (Heflish et al., 2021).
En
Panamá la mayor producción del cultivo de tomate industrial (Solanun
lycopersicum) se da en la península de Azuero, específicamente en el
distrito de Los Santos, provincia de Los Santos. Datos del Ministerio de
Desarrollo Agropecuario (MIDA, 2014) indican que en el Arco Seco de Panamá se
cultiva el 80% de este rubro. El cultivo se da
principalmente durante la estacion seca, reportanto una superficie total de 147
hectareas y un rendimiento promedio de 46,9 t/ha
Las estrategias utilizadas tradicionalmente
para el control de plagas han provocado:
degradación de los agroecosistemas, contaminación del medio y daños a la
salud de los productores y consumidores. Esto representa una amenaza para el
desarrollo sostenible de cualquier región. En ese sentido, se presenta el reto
de encontrar alternativas tecnológicas más eficientes para la producción
agrícola (MacLaren et al., 2020).
El uso indiscriminado de agroquímicos también
disminuye la calidad de los suelos, ya que con su aplicación se eliminan la
mayoría de los organismos presentes, sin distinción entre patógenos y
benéficos, por lo que es necesario que se dé un adecuado manejo del recurso,
esto implica el mantenimiento de su estructura y composición. Además, en caso de
que se requieran se adiciona nutrientes esenciales mediante la aplicación de
abonos orgánicos según las recomendaciones de fertilización dada por los
análisis fisicoquímicos del suelo (Medina
Mendoza y Vélez Medina, 2018).
En la actualidad, con el desarrollo
tecnológico se han generado avances en la agroindustria y biotecnología, esto
ha permitido conocer los beneficios que aportan los microorganismos para el
desarrollo de la vida y calidad de los suelos. De manera que estos puedan
aplicarse de manera eficiente. Esto es de gran importancia para el futuro
alimenticio de la población en crecimiento que cada día demanda una mayor
cantidad y calidad de alimentos (Rea-Sánchez et al., 2015).
El objetivo principal de esta investigación fueron
aislar e identificar hongos del género Trichoderma sp., el cual se ha reportado como un
agente de biocontrol eficaz y conocer la diversidad fúngica presente en suelos
dedicados al cultivo del tomate (S.
lycopersicum).
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de estudio
Para este trabajo se seleccionaron ocho sitios (Cuadro 1) ubicados en la
provincia de Los Santos, distritos de Los Santos (cinco fincas) y Tonosí (tres
fincas) (Figura 1). La principal característica para la selección de las fincas
era que se hubiera sembrado tomate al menos un año antes o que se estuviera
cultivando durante el transcurso de la investigación. Las muestras fueron
tomadas a inicios de la estación lluviosa (mayo).
Colecta de muestra
En cada finca se trazó una parcela, en donde se seleccionaron cinco puntos
para la colecta de muestra (Figura 2). Luego se tomaron aproximadamente 500 g
de suelo a una profundidad de 20 cm, ya que esta es la profundidad que más o
menos alcanzan las raíces. Las muestras se almacenaron en frío para su
posterior análisis en Laboratorio.
Análisis estadístico
Se analizó el coeficiente de correlación de Pearson para variables
cuantitativas (géneros de hongos filamentosos aislados y las Unidades
Formadoras de Colonias) y el índice de Simpson para determinar la abundancia de
géneros aislados.
Análisis de suelo
El análisis fisicoquímico del suelo se realizó únicamente en cuatro
sitios (El Faldar, Tonosí, Tonosí Centro y La Colorada) por ser consideradas
las fincas de mayor producción de tomate. El análisis fue realizado por el
Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá (IDIAP). También, se realizaron
pruebas bioquímicas en Laboratorio para determinar la actividad biológica del
suelo, las cuales se describen a continuación:
Actividad de la Enzima Deshidrogenasa
La determinación de la actividad de la enzima deshidrogenasa (ADH) en
los suelos está relacionada con el contenido de Materia Orgánica (MO) y puede
utilizarse como indicador biológico, e índice de Actividad Microbiológica
(IAM). Para determinar dicha actividad se realizó el Método de Casida et al.
(1967), descrito a continuación:
Se colocaron 6 g de
suelo húmedo en tubos de ensayo suplementado con 50 mg de glucosa para acelerar
el proceso de activación de los microorganismos. Luego se añadieron 2 mL de
agua destilada y 1 mL de Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC) al 3%. Se
homogeneizó la mezcla hasta obtener una consistencia lodosa. Cada tubo fue
cubierto con papel aluminio e incubado en oscuridad, a una temperatura de 26°
C±2 por 8 días. Transcurrido este tiempo se añadió 25 mL de metanol a cada
tubo. Se homogeneizó nuevamente y se dejó reposar hasta la precipitación de las
partículas de suelo. Se filtró el sobrenadante con la ayuda de un sistema de
filtrado al vacío y se colocó en un tubo hasta obtener un volumen de 25 mL.
Finalmente, se tomó lectura por espectrofotometría a una absorbancia de 485 nm.
Como blanco se utilizó una mezcla que contenía:
2 mL de agua, 1 mL de TTC y 25 mL de metanol.
Contenido de humedad en suelos
En análisis microbianos, para determinar el contenido de humedad es
usualmente reportado como el porcentaje de humedad relativa. Este se define
como:
(m) es la masa de suelo
húmedo antes del secado y (d) es la masa de suelo luego de secado al horno.
Respiración microbiana
Inicialmente se realizó la incubación de las muestras, para esto se
seleccionó un frasco de vidrio de boca ancha con cierre hermético, en donde se
añadieron 25 g de suelo húmedo. El cual se mantuvo en oscuridad a 26° C durante
10 días. Adicional, se utilizaron envases pequeños de plástico, los cuales
contenían: 10 mL de NaOH 0,1M y 10 mL de agua destilada. Para el blanco o
control se realizó el montaje con NaOH sin suelo. La solución de NaOH se cambió
periódicamente, los días 1°, 2°, 4°, 7° y 10° de la incubación.
Se determinó la
concentración de CO2 capturado. Para ello, se procedió a tomar una
alícuota de 2 mL de cada tratamiento y se le añadió agua destilada (1-2 mL
aprox.). Siguiendo la siguiente reacción:
CO2 (g) +
NaOH (ac) → Na2CO3 (ac) + NaOH (ac) sin reaccionar
Previamente,
a la titulación se adicionó 1 mL de BaCl2 al 20%, para que los
carbonatos que se formaron se precipitaran en forma de BaCO3 de
acuerdo con la siguiente reacción:
Na2CO3
(ac) + BaCl2 (ac) → 2NaCl (ac) + BaCO3
La técnica implicó
calcular la cantidad de NaOH que queda sin reaccionar en el proceso de
respiración (exceso), valorándolo con HCl 0,1 M en una bureta, utilizando azul
de timol 1% como indicador. El CO2 emitido por el suelo se calculó
como la diferencia entre el valor de titulación de un blanco sin suelo (NaOH) y
el de cada muestra expuesta a la actividad microbiana (NaOH + CO2
[suelo]). La cantidad de CO2 desprendido de la mineralización se
determinó mediante la siguiente ecuación:
CO2
= (B-M) x NHCl x Peq x A x 100 / [25(ss/sh)]
Dónde: CO2 =
mg CO2 · 100 g-1 de
suelo seco a 105° C; B = volumen de HCl consumido por el blanco; M= volumen de
HCl consumido por la muestra; NHCl= concentración o normalidad exacta del ácido
clorhídrico; Peq = peso equivalente del CO2 emitido (44/2); A =
alícuota de la muestra expuesta al suelo (10/2); Ss/sh = relación de suelo seco
a 105° C Y suelo húmedo (en gramos).
Aislamiento microbiano
El análisis de las muestras de suelo se realizó en los Laboratorios de
Microbiología y Parasitología de la Universidad de Panamá, durante los años
2016 y 2017. Siguiendo la metodología de Hernández et al. (2016) se realizaron
diluciones seriadas de 10-1 a 10-6. Posteriormente, se
extendieron 100 μl de cada dilución en platos Petri de 20 mL con medio agar
papa dextrosa (PDA) + ácido tartárico (1,4%) previamente preparado (Figura 3).
Este procedimiento se realizó con sus correspondientes réplicas.
Identificación
Los aislamientos se transfirieron a viales de
10 mL, conteniendo 5 mL de agar (PDA) inclinado y se incubaron a 25-28° C. El
criterio empleado para la identificación fue la categoría morfotipo para
estructura vegetativa, mientras que aquellos aislamientos que desarrollaron
estructuras reproductivas se identificaron mediante las claves de (Watanabe,
2010).
Las características
empleadas para la agrupación morfológica fueron las siguientes: tasa de
crecimiento (lento, moderado o rápido), presencia o ausencia de micelio aéreo,
textura del micelio (18 categorías), forma del margen (liso, irregular, flecos
entre otros), elevación o profundidad de la colonia (convexo, plano, tubo
cubierto de micelio entre otros) presencia de cuerpos fructífero, color del
agar y del micelio aéreo (Moller et al., 1995). La caracterización taxonómica se realizó con la
comparación y agrupamiento de los aislamientos por cada muestra de suelo.
Caracterización de morfotipos mediante el método de
microcultivo
Este método de
microcultivo es el más preciso, ya que permite observar las estructuras
fúngicas in situ. Para su realización
se utilizó un plato Petri con un caballete de vidrio en forma de U.
Inicialmente se depositaron 5 mL de agua estéril en el plato y se colocó un
portaobjeto sobre el caballete, luego con una pipeta estéril se vertió una capa
de agar en la superficie de la lámina (Arenas, 1983).
Se inoculó el centro con
un fragmento del cultivo y se fijó con un cubreobjeto estéril. Se incubo a la
temperatura seleccionada para cada aislamiento. Pasado el tiempo se retiró el
cubreobjeto y se añadió una gota de azul de lactofenol para su observación al
microscopio (40X y 100X) (Arenas, 2003; Casas, 1989).
Técnica de cinta adhesiva
Esta técnica es una de
las más utilizadas debido a que se conserva la yuxtaposición original de las
esporas y el segmento de hifas (Koneman y Roberts, 1987). Además de permitir
observar las estructuras fúngicas casi sin alteración (Arenas, 1993).
Para
esta prueba se tomó cinta adhesiva de 4 cm con pinzas estériles y con el lado
adhesivo hacia fuera, se presionó firmemente contra la superficie de las colonias
de estudio. Posteriormente, la cinta se colocó en un portaobjeto con una gota
de azul de lactofenol.
Preservación en glicerol y agua estéril
Los hongos se almacenaron en glicerol al 30%. Se realizó una suspensión
para cada hongo, con el objetivo de obtener la mayor cantidad de esporas.
En los platos Petri se
colocaron los aislamientos hasta que se cubriera en su totalidad el plato,
luego se le añadió 2 mL de agua estéril y se procedió a frotar la superficie
del plato para levantar la mayor cantidad de esporas.
Para cada aislamiento se
tomaron dos crioviales, en uno se añadió 10 µL de la suspensión de esporas +
990 µL de agua estéril para efectuar una dilución 1/100 y efectuar el, conteo
de esporas. En el otro criovial se agregó 700 µL de la suspensión de esporas +
300 µL de glicerol, y se agitó por 1 min, para luego almacenarse a -80° C.
RESULTADOS y
DISCUSIÓN
Propiedades fisicoquímicas de los sitios de
muestreo
El suelo de las cuatro fincas seleccionadas presentó un color
amarillento, con una textura franco-arenosa. En la zona del “Arco Seco” de
Azuero, la evaporación supera la precipitación anual, lo que contribuyó a que
los suelos de estudio presentaran (0,10 cmol/kg) (Villarreal-Núñez et al.,2012)
y consecuentemente presentaran un bajo nivel de saturación de aluminio.
Los análisis hechos por
el IDIAP determinaron que los niveles de materia orgánica fueron bajos,
manteniéndose en un rango entre 0,48%- 1,75%; estos suelos también presentaron
niveles de pH poco ácidos (6,10 – 6,90), con la excepción de la Colorada que
presento un pH de 5,60 (ácido); además se comparó la Capacidad de Intercambio
Catiónico (CICE) (Cmol/kg) de las muestras. Estas se mantuvieron en niveles
medio a excepción de la Colorada con 41,35 (Alto). Estos datos coinciden con lo
planteado por (Villarreal-Núñez et al., 2012), en donde indican que en los últimos años ha habido una reducción
en el contenido de MO en la península de Azuero.
En general, los suelos
de Panamá están lavados o lixiviados, son de textura franco-arcillosa o de
arcilla liviana, con pH ligeramente ácido, presentan bajos contenidos de
fósforo y medianos o bajos contenidos de materia orgánica. El nivel deseable de
MO en los suelos arcillosos medios es del 2%, pudiendo descender a 1,65% en
suelos pesados y llegar a un 2,5% en los arenosos, el cuál encaja con las
muestras de nuestro estudio, sin embargo, los valores obtenidos fueron muy
bajos (Gros y Domínguez,1992)
Respiración microbiana
El suelo que presentó mayor tasa de
respiración microbiana fue el de La Colorada, con 54,15 mg CO2 • 100
g-1. Cabe señalar que este suelo también presentó el mayor
porcentaje de humedad, con un 9,2%. En segundo lugar, El Faldar con 47,61 mg CO2
• 100 g-1 y un porcentaje de humedad de 5,2%. En Tonosí se presentó
un 45,05 mg CO2 • 100 g-1 con un porcentaje de humedad de
4,8. El menor porcentaje de respiración fue Tonosí Centro con un 37,03 mg CO2
• 100 g-1 con un porcentaje de humedad de 5,4% (Figura 4).
Cuando existen
condiciones aeróbicas en el suelo, gran parte del carbono que ingresa al mismo
es lábil y solo una pequeña fracción se acumula en la fracción húmica estable.
Según Sánchez-González et al. (2006) aunque el carbono del suelo es susceptible de
perderse por deforestación o alteraciones, el suelo puede ser un almacén de
carbono o bien convertirse en una fuente de emisiones de CO2. Lo
segundo puede estar ligado al cambio en el uso de la tierra y factores
ambientales. En nuestro caso esto se presenta debido a la acción antropogénica
realizada con el objetivo de producir cultivares de tomates para la venta.
Actividad
deshidrogenasa en suelos
La finca de Tonosí Centro presentó una mayor
absorbancia, mientras que La Colorada mostró menor valor. La actividad de la
enzima deshidrogenasa (ADH) está relacionada con la tasa de MO y puede
utilizarse como indicador biológico tal como señala la Norma de suelos de
Panamá en el Decreto Ejecutivo # 2 de 14 de enero de 2009 (gaceta oficial
26201).
Los porcentajes de humedad del 18%, obtenidos en este trabajo,
registraron una mayor actividad deshidrogenasa (Figura 5). Mientras que Brzezińska et al. (1998) reportan que con un incremento de agua en el suelo
hay una mayor ADH, ya que se reduce el estado de aireación por la disminución
del espacio de los poros para la difusión de gases. En nuestro caso, las
condiciones de estudio no alcanzan ni la mitad de los valores de porcentajes de
humedad que se establecieron en los trabajos anteriormente mencionados. Por lo
cual, no pueden compararse. En ese sentido, se requiere de más estudios en
suelos agrícolas con menores porcentajes de humedad.
Valoración de las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC)
Se encontró que las diluciones de 10-3
a 10-4, se mantuvieron constantes en la presencia de colonias en
casi todos los sitios de muestreo, con excepción de la muestra de Llano Largo,
donde la dilución más efectiva fue 10-6 (Figura 6).
La interacción de las variables de los géneros de hongos filamentosos
aislados y las UFC tuvo un coeficiente de correlación de Pearson de -0,7, lo
que indica que ambas variables tienen una relación lineal negativa (-1˂r˂0)
inversa, a medida que aumentan los valores de x disminuyen los de y donde se
obtuvo r= 0,72748; y el r2 = 0,5292. Esto no es significativo, ya
que el coeficiente de determinación es r2 =53%, p˃0,05. El r2
significa que las unidades formadoras de colonias son responsables del 53% de
la variabilidad en el número de géneros de hongos filamentosos (Figura 7).
Para medir la abundancia de géneros de hongos
filamentosos, se calculó el índice de Simpson, el cual permite medir la
dominancia y diversidad. De acuerdo con nuestro grupo de datos, el índice de
dominancia de Simpson fue un valor de 0,13769531, lo que indica que la
dominancia es baja, mientras que el índice de diversidad de Simpson dio un
valor de 0,86230469 indicando una alta diversidad (Cuadro 2).
De la interacción entre las variables de géneros de hongos filamentosos
aislados y las UFC, se obtuvo un coeficiente de correlación de Pearson de -0,7,
lo cual indica que tienen una relación lineal negativa, coincidiendo este
resultado con el estudio realizado por Pacasa-Quisbert
et al. (2017) utilizando este estadístico, donde se buscaba la relación entre las UFC
y factores físicos (% de MO) que influyen en el número de géneros de hongos
filamentosos aislados.
Los géneros de mayor incidencia fueron: Aspergillus sp. con 34%, Penicillum sp. con 20% y un 23% de micelio
estéril. Mientras que los de menor
incidencia fueron: Paecilomyces sp.,
Fusarium sp., Colletotrichum sp, Ramichloridium sp., Rhizopus
sp., Scopulariopsis sp., Geotrichum sp., Cladosporium sp.,
Pythium sp., Mucor sp., Trichoderma sp., Cunninghamela sp.,
Curvularia sp., levaduras y micelio estéril, con porcentajes menores
al 4%.
A pesar de que muchos de los géneros aislados actúan como saprófitos,
algunas especies son fitopatógenas bajo ciertas condiciones, pero en zonas de
sabana tropical como las estudiadas en este trabajo, las cuales son similares a
las zonas semi áridas o áridas, existen hongos característicos, como Aspergillus
y Penicillium (Silverio et al.,1991). Hay que acotar que las
especies presentes pueden variar según la acidez o basicidad que se presente el
suelo.
Características
macroscópicas de los aislamientos
Las colonias de los géneros aislados en este
estudio se presentan en la Figuras 8 y las características macroscópicas de
cada uno se describen en el Cuadro 3.
Características microscópicas
Las
estructuras reproductivas de los hongos aislados se presentan en la Figuras 9 y
cabe destacar que algunas cepas mostraron un escaso crecimiento y no hubo
generación de dichas estructuras.
CONCLUSIONES
·
Se determinó un total de
340 hongos aislados en platos Petri; alrededor de 576 inclinados (morfotipos).
· Con
el cálculo de las UFC se pudo determinar que la carga fúngica óptima se
encuentra en la dilución 10-4.
· Los
aislamientos de hongos se agruparon en un total de 15 géneros, basados en sus
características morfológicas y microscópicas. Los cuales fueron: Aspergillus
sp., Penicillium sp.,
Paecilomyces sp., Fusarium sp., Colletotrichum sp.,
Ramichloridium sp., Rhizopus sp., Scopulariopsis sp.,
Geotrichum sp., Cladosporium sp., Phytium sp., Mucor sp.,
Trichoderma sp., Cunninghamela sp., Curvularia sp.
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