CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE MICROORGANISMOS DE
MONTAÑA Y SUS EFECTOS EN EL RENDIMIENTO DE Eryngium
foetidum[1]
Lisbeth L. Rodríguez[2]; Rito Herrera[3]; Betzaida Bernal[4]; José Luis Causadías[5]; Joaquín López Zúñiga[6]; Octavio De La Cruz Sánchez[7]
RESUMEN
Palabras clave: Biol, culantro, fertilizante orgánico, promotores
de crecimiento vegetal, secuenciación.
FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF MOUNTAIN MICROORGANISMS (BIOLES) AND
THEIR EFFECTS ON Eryngium foetidum YIELD
ABSTRACT
Mountain microorganisms
(MM) have been applied artisanally as organic fertilizers in agricultural
soils, obtaining promising results. The objectives of this research were: to
characterize the bacteria present in a biol obtained from mountain soils, to
quantify the performance as a fertilizer of the coyote culantro crop (Eryngium foetidum L.) and to determine
its optimal dose. The field work was carried out in the community of Bajo
Bonito, located in Capira, Panamá Oeste. The experimental design was a
randomized complete block, with six treatments (biol dose) and four blocks. The
chlorophyll level and yield (kg/treatment) were evaluated. The statistical
analysis concluded that treatment 5 (100 ml biol/17.90 L water) was the most
efficient for the fertilization of culantro. The soil studied, not being
treated with agrochemicals, maintains its structure and function, so it turned
out to be suitable for agricultural production. Regarding laboratory work, 34
strains were isolated, which were subjected to different biochemical tests,
proving to be efficient in promoting plant growth, with siderophore producers
standing out among all the groups. Additionally, the following strains were
identified: Lysinibacillus fusiformis, Bacillus kochii, Methylobacterium sp. and Bacillus velezensis,
through 16S ribosomal RNA gene sequencing. The application of bioles is
presented as a sustainable alternative for the environment, as well as for
small and medium-sized farmers seeking to improve their crop yields and provide
a higher quality product to consumers.
Keywords: Biol, culantro, organic fertilizer, plant growth promoters, sequencing.
INTRODUCCIÓN
La caracterización
microbiológica ha permitido identificar y aplicar microorganismos benéficos de
manera eficiente en la agricultura (Molina-Romero et al., 2015). El efecto
positivo de estos en los cultivos dependerá de su capacidad para: fijar nitrógeno, solubilizar fosfato,
secretar sideróforos y producir fitohormonas (Rodríguez-Chávez, 2020).
En los últimos años se
ha destacado el papel de los biofertilizantes como alternativa tecnológica de
fertilización sostenible (Tomer et al., 2016). El biol es un fertilizante
orgánico líquido rico en microorganismos y nutrientes (Álvarez-Solís et al.,
2010).
El culantro coyote (Eryngium
foetidum L.) es una planta
aromática originaria de la región amazónica y centroamericana (Villachica,
1996) con gran importancia comercial debido a su uso en la gastronomía (Morales
et al., 2013). En la comunidad de Bajo Bonito ubicada en Capira, Panamá Oeste,
hay familias que se dedican al cultivo de este rubro en condiciones orgánicas
(libre de agroquímicos), ya que como fertilizante utilizan un biol artesanal a
base de microorganismos de montaña (MM), el cual es preparado por los
agricultores del área.
Lo que distingue al biol
de este estudio, es que dentro de sus ingredientes destacan los MM, los cuales
están constituidos por colonias de hongos, bacterias y levaduras benéficas que
se encuentran de manera natural en bosques que no han sido perturbados por las
acciones antropogénicas. Estos microorganismos tienen la capacidad de promover
el crecimiento vegetal y suprimir o controlar microorganismos fitopatógenos
(Suchini-Ramírez, 2012).
El principal método
utilizado para controlar las plagas y/o enfermedades, y aumentar el rendimiento
de los cultivos es la aplicación de agroquímicos (Salazar y Aldana, 2011). Sin
embargo, su uso desmesurado ha traído repercusiones en el ambiente, como lo
son: la eutrofización, contaminación y pérdida de biodiversidad (Zepeda-Jazo,
2018). Adicional a esto, presentan precios bastante elevados, lo que no es
sostenible para los pequeños y medianos productores, quienes en ocasiones se
ven obligados a detener sus cosechas por falta de recursos.
El ingreso de compuestos
sintéticos en el suelo afecta a los microorganismos presentes y su actividad,
por consiguiente, ocasionan modificaciones en los procesos biológicos que son
necesarios para la productividad y fertilidad de los cultivos (Cycon et al.,
2013). En Panamá la contaminación por la actividad agropecuaria data desde
1960, con el incremento marcado en el uso de plaguicidas, producto de la
revolución verde en América Latina y el Caribe (Espinosa-Tasón y Barba, 2014).
En búsqueda de alternativas más amigables con el ambiente surgió esta
investigación.
El objetivo principal de
este trabajo fue caracterizar funcionalmente los microorganismos presentes en
un biol obtenido a partir de suelos de montaña. En cuanto los objetivos
específicos están: Determinar la dosis óptima del biol de microorganismos de
montaña y cuantificar el rendimiento del biol utilizado como fertilizante en el
cultivo del culantro coyote (E.
foetidum L.).
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de estudio
El trabajo de campo
se realizó de julio de 2021 a febrero de 2022 en la comunidad de Bajo Bonito,
ubicada en el corregimiento de El Cacao, distrito de Capira, provincia de
Panamá Oeste, a una altitud de 600 msnm en las coordenadas geográficas latitud
8°43'30,0"N y longitud 80°03'21,6"W (Figura 1). El sitio se encuentra
en la zona de vida bosque húmedo tropical (Holdridge, 1987), con una
temperatura promedio de 24° C, precipitación media anual de 2 500 mm.
Preparación del biol
Se agregaron 12 kg de suelo de montaña en un saco y
se amarró, posteriormente se sumergió en 180 L de agua junto con 4 L de melaza.
Se introdujo este saco en un tanque con capacidad para 200 L y se procedió a
tapar con una tela para evitar el ingreso de insectos, luego de esto se colocó
el recipiente en un lugar fresco, sin exponer al sol y a temperatura ambiente
durante 15 días. Esta fue la “solución madre” de donde se obtuvieron los
Microorganismos de Montaña (MM) líquidos en condición aeróbica. La preparación
fue realizada por los productores de la comunidad con la asesoría de los
técnicos del Ministerio de Ambiente, específicamente del Centro de Desarrollo
Sostenible Ambiental (CEDESAM). Finalmente se realizó la siembra de manera
manual, según cantidad utilizada regularmente por los agricultores.
Diseño experimental
El
área total del ensayo fue de 161 m2, se utilizó el diseño de Bloques
Completos al Azar con cuatro repeticiones y seis tratamientos (Cuadro 1). Las
unidades experimentales fueron de 3x1 m separados por pasillos de 1 m.
Aislamiento microbiano
El análisis del biol se realizó en el Laboratorio
de Microbiología Agrícola del Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá
(IDIAP) entre los meses de febrero y septiembre de 2022. La muestra utilizada
se tomó el 17 de febrero del mismo año. Siguiendo la metodología de Hernández
et al. (2016) se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-6.
Posteriormente se extendieron 100 μl de cada dilución en platos Petri de 20 ml,
con sus correspondientes réplicas.
Los medios de cultivo seleccionados para este
ensayo fueron: el agar tripticasa soya (TSA) por ser un medio nutritivo general
con variedad de usos y el medio Ashby, libre de nitrógeno, ya que este se
emplea para el aislamiento de microorganismos con capacidad de fijar nitrógeno
atmosférico (Salazar y Ordoñez, 2013). La incubación fue a 28° C durante 48-72
horas.
CARACTERIZACIÓN
FUNCIONAL DE MICROORGANISMOS
Producción de sideróforos
Este ensayo se basa en una competencia por el
hierro entre el complejo férrico de un colorante indicador, cromoazurol S
(CAS), y un sideróforo producido por el microorganismo (Milagres et al.,1999).
Siguiendo la metodología de (Schwyn y Neilands, 1987) se preparó la solución
de CAS y se almacenó a 4° C hasta el momento de su uso. Para la estimación
cualitativa se preparó medio TSA y se sirvió en platos Petri de 10 ml, luego se
procedió a cortar en dos mitades y se retiró una de ellas. El espacio vacío se
reemplazó con el Agar CAS preparado previamente. Se inocularon los aislados en
la mitad con el medio TSA, teniendo en cuenta no sobrepasar el borde que divide
ambos medios.
La incubación se realizó en la temperatura de
crecimiento adecuada para cada cepa y se situaron en un lugar oscuro por dos
semanas. Pasado este tiempo se observó el crecimiento de las cepas y se
verificó la reacción CAS mediante el avance en el cambio de color del medio
selectivo, iniciando a partir de la línea borde que divide ambos medios. Se
tomaron mediciones al 5to, 10mo y 15vo día.
La cuantificación de la producción de
sideróforos se realizó siguiendo la metodología propuesta por (Arora y Verma, 2017). Para esto se cultivaron las
cepas en medio TSA liquido durante 48 horas a 28° C. Después de la
incubación, se tomó 1 ml de cada cepa y se colocó en un tubo de centrífuga de
1,5 ml, estos cultivos bacterianos se centrifugaron a 10 000 rpm durante 10
minutos. Luego se tomó el sobrenadante (0,5 ml) y se mezcló con 0,5 ml del
reactivo CAS. Esto se incubo en oscuridad por 20 minutos, transcurrido este
tiempo se realizó la lectura de la densidad óptica a 630 nm. El sideróforo
producido por las cepas se midió en unidad porcentual de sideróforo (psu) que
se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula
(Ar – As)
x 100
Ar
donde Ar = absorbancia de referencia (solución
CAS y sin inocular caldo), y As= absorbancia de la muestra (CAS solución y
sobrenadante libre de células de la muestra).
Solubilización de fosfatos
Esta prueba se realiza con la finalidad de
encontrar microorganismos solubilizadores de fosfato, los cuales son
reconocidos por ser promotores del crecimiento vegetal
Los aislados bacterianos se inocularon
puntualmente en el centro de los platos manteniendo las técnicas de asepsia.
Todas las placas se incubaron en oscuridad a 28° C±2 durante 7 días.
Transcurrido este tiempo se midió el índice de solubilización de fosfato en
aquellos que presentaron un halo claro alrededor de la colonia de crecimiento.
Con estos resultados se calculó el índice de solubilización de fosfato (PSI):
relación del diámetro total (colonia + zona de halo) a la colonia diámetro.
Concentración de ácido
indolacético (AIA)
La metodología de Mantilla (2007) y Ozdal et
al. (2017) se realizó inicialmente con una curva patrón a partir de diferentes
concentraciones de (AIA) (Cuadro 2). A cada patrón se le adicionó 2 mL, del
reactivo de Salkowski, esto se incubo en oscuridad durante 30 minutos y se
determinó la absorbancia a 530 nm. Para el blanco se utilizó agua destilada sin
adición del reactivo.
Se preparó un pre-cultivo bacteriano en medio
(TSA), el mismo se colocó en un rotador a 150 rpm por 24 horas. Una vez
transcurrido el tiempo de crecimiento, se llevó cada cepa a una concentración
conocida de 1x106 UFC/ml, en 20 ml de medio TSA (conteniendo 0,1 g/L
de L-triptófano).
Los aislados se incubaron en oscuridad a 150
rpm, por 144 horas. Después del periodo de incubación, se procedió a tomar 1,3
ml de cada solución bacteriana y se colocó en tubos de 1,5 ml para su
centrifugación a 12 000 rpm por 5 minutos. Se retiró 1 ml del sobrenadante y se
mezcló con 2 ml del reactivo de Salkowski. Se agitó por inversión e incubó por
30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Transcurrido este tiempo se
tomó la lectura en el espectrofotómetro a 530 nm.
La cantidad de AIA cuantificada se comparó
con la curva estándar de AIA preparada previamente. Las lecturas se realizaron
a las 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas. A partir de los datos de absorbancia y
la ecuación de la recta de la curva de calibración, se determinó la
concentración de AIA producida.
Fijación no
simbiótica de nitrógeno
A partir de un
cultivo bacteriano en medio sólido (TSA) se realizó un pre-cultivo de las
bacterias seleccionadas en medio Ashby y TSA líquido. Con asa bacteriológica
estéril, se tomó una pequeña porción y se inoculó en matraces con 25 ml de
medio líquido. Luego, a partir del pre-cultivo, se estableció el cultivo
bacteriano con una concentración inicial de 0,1 células por millón.
Seguidamente, se monitoreo el crecimiento bacteriano por un periodo de 9 horas,
haciendo mediciones cada 30 minutos a 540 nm. Con los datos obtenidos se
realizó la curva de crecimiento.
Extracción y Cuantificación de ADN
Como material de muestra se utilizaron aproximadamente 40 mg de pellet
de cultivo celular microbiano de peso húmedo. Para la extracción de ADN se
utilizó un kit de extracción comercial. La cuantificación del ADN genómico
total se realizó agregando 2 μl
de cada muestra en un espectrofotómetro de microvolúmenes.
Caracterización Molecular de las cepas
bacterianas
Para la identificación molecular se utilizaron las regiones 16S RNA
ribosomal. Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los
siguientes cebadores: 9_F 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ y 1490R
5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’. Las condiciones de PCR corresponden a (Bruner et
al., 2013). La secuenciación de los productos de PCR se llevó a cabo por Next
Generation Sequence (NGS) y se utilizó la base datos Gene Bank.
Análisis físico químico del suelo
En campo se tomó la muestra de suelo correspondiente para el análisis
fisicoquímico, este se realizó en el Laboratorio de Nutrición y Suelos de la
Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá.
Análisis estadístico
Los datos utilizados para el análisis estadístico se obtuvieron después
de tres giras de campo, en donde se tomaron en cuenta el nivel de clorofila y
peso (kg). Esto con la finalidad de determinar la dosis optima del biol y
cuantificar el rendimiento de este como fertilizante en el cultivo del
culantro. Los datos fueron analizados por análisis de varianza (ANOVA).
RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Producción de sideróforos
Los 34 aislados bacterianos se sometieron a la reacción de CAS para
evaluar la producción de sideróforos de manera cualitativa y cuantitativa
(Cuadro 4). La unidad porcentual de sideróforo más alta a las 24h está
representada por la cepa 19 con un valor de 64,7±21,4 mientras que la más baja
que corresponde a la cepa 4 con un valor de 8,9±2,8. Pasadas las 48h se observó un aumento del
(psu) en el 64% de las cepas, obteniendo la unidad porcentual de sideróforo más
alta en la cepa 6 con un valor de 57,8±4,7y la más baja de 12,9±5,3 en el
aislado 26.
Un estudio de rizobacterias productoras de sideróforos realizado por Barrera (2016) indica que la producción
máxima de sideróforos después de 24h de cultivo fue de 22,8 ±2,5 psu, el resto
de los aislados se encontraron en un rango de 8,5-15,6. Mientras que Arora y
Verma (2017) en una investigación para optimizar la metodología detección de
sideróforos producidos por bacterias, obtuvieron como mayor psu 69,16 ± 0,71 a
las 48h, oscilando el resto de las cepas entre 07,97 y 45,99. En nuestro caso
la mayor producción de sideróforos a las 24h fue de 64,7±21,4 en el aislado 19.
A las 48h, 28 de las 34 cepas presentaron valores mayores a 30 psu, lo que se
considera una alta producción de sideróforos (psu). Este tipo de bacterias
implican un gran beneficio en los cultivos, ya que los sideróforos pueden
secuestrar el hierro del ambiente rizosférico, impidiendo que sea disponible
para los patógenos, siendo esto un mecanismo de control (Kloepper et al., 1980; Loper y Schroth, 1986).
Solubilización de fosfatos
De las 34 cepas analizadas dos presentaron la capacidad de solubilizar
fosfato tricálcico en medio PVK (Figura 2). Con los resultados obtenidos se
midió el índice de solubilización de fosfato (PSI) (Cuadro 3).
En los suelos ácidos se
forman fosfatos de aluminio y de hierro (Parfitt y Kimble, 1989; Sanyal y De Datta, 1991),
mientras que en suelos neutros-alcalinos predominan fosfatos de calcio (Lindsay et al., 1989). Estas
formas de fosfato son insolubles, por lo que no son asimilables por las
plantas.
La detección de cepas con capacidad
de solubilizar fosforo insoluble se mide cualitativamente mediante el medio
selectivo sólido de Pikovskaya, calculando así el índice de solubilización. En
esa línea la tesis de Ibarra (2016) indica
para Sinorhizobium spp.,
índices que van de 3,04 a 3,39. Por su parte Tripti et al. (2012) reportaron para Pseudomonas sp.
y Bacillus sp. índices
de solubilización de 3,1 a 3,0, respectivamente. Mientras que en cepas aisladas
por Restrepo-Franco
et al. (2015) en el cultivo de arroz los valores van de 2,14 a 2,61.
En nuestro caso dos de las 34 cepas estudiadas mostraron la capacidad de
solubilizar fosfato obteniendo IS de 3,04 a 3,05. En este trabajo no se realizó
la estimación cuantitativa de fosforo por lo que no podemos asegurar que el
resto de las cepas no presenten la capacidad de solubilizar fosfato insoluble.
Cuantificación de AIA
La producción más alta de ácido indolacético se dio a las 144h y
corresponde a la cepa 27 con un valor de 27,9±10,8, mientras que la más baja
fue de 5,6±4,2 para la cepa 25 a las 96h. Se observó un aumento en la producción
de la fitohormona al día 6 en 70% de las cepas (Cuadro 4).
Varios factores pueden influir en la
biosíntesis de esta auxina, tales como el pH y la concentración de triptófano (Lebrazi et al., 2020; Spaepen et al., 2009). En base a esto, Lebrazi et al. (2020) realizó un
estudio donde determinó que el mejor pH para rizobacterias aisladas de Acacia
cyanophylla es uno básico, ya que la máxima producción de AIA se detectó en
un pH de 9 (116,07 μg ml-1), para Mohite (2013) las mayores cantidades se produjeron en pH
neutros-básicos (7-9), en cambio un pH de 6 resultó ser desfavorable para la
producción. Chandra et al. (2018) indican resultados
similares a lo mencionado por Mohite
(2013), ya que la
cantidad de AIA varió de 74,3 μg ml-1 a pH 5 a 91,7 μg ml 1
a pH 9. En nuestro trabajo de caracterización se utilizó un pH de 6,7 y el
mayor valor fue de 27,9 μg ml -1, bastante inferior a lo reportado
por otros autores. Con respecto al efecto de las concentraciones L-Trp en la
síntesis de ácido indolacético, Patten y
Glick (2002) utilizaron diferentes concentraciones, estas fueron: 0, 50, 100, 200 y
500 μg/ml de triptófano, reportando que conforme aumentaba la concentración era
mayor la producción de AIA. En cambio, Lebrazi et al. (2020) observó que a
mayor concentración de L-Trp, menor la cantidad de AIA producido. En nuestro
caso se utilizó 50 μg/ml de triptófano. De manera general, Escobar et al. (2011) obtuvieron valores de
10,44; 11,99; 14,21 y 57,99 μg ml-1 para cepas nativas de Azotobacter
spp. aisladas del tomate (Lycopersicon
esculentum Mill.). Nuestros
valores oscilaron entre 5,6 y 27,9 μg ml-1, manteniéndose
principalmente por debajo de 20 μg ml -1. En base a lo obtenido por
otros autores le podemos atribuir este hecho a la baja concentración de
triptófano y al pH acido presente en el medio de cultivo.
Fijación no simbiotica de nitrógeno
Para
esta prueba se seleccionaron cinco de los 34 aislados bacterianos. En la Figura
3 se presenta el promedio de las densidades ópticas a 540 nm de las cepas 7,
15, 30, 32 y 34, en función del tiempo (h).
Identificación Molecular
Se
identificaron mediante secuenciación del gen 16S RNA ribosomal las cepas Lysinibacillus fusiformis, Bacillus kochii, Methylobacterium sp., Bacillus
velezensis.
Análisis de suelo
Se presentó un alto contenido de Fósforo - P
(115 ppm), Calcio - Ca (24,55 meq/100g), Magnesio - Mg (1,99 meq/100g),
Manganeso - Mn (103 ppm) y Zinc - Zn (43 ppm).
En un rango medio se ubica la Materia Orgánica - MO (3,04%) y el Hierro
- Fe (40 ppm). Finalmente, en
concentraciones bajas se encuentra el Potasio - K (43 ppm), Sodio - Na (38
ppm), Aluminio - Al (0 meq/100g) y Cobre - Cu (2 ppm) (Cuadro 5).
En el corregimiento de Río Hato se encuentran
diferentes fincas dedicadas a la producción agrícola, estudios de estos suelos
indican una baja materia orgánica, bajo contenido de nutrientes y un pH ácido.
Reportando así suelos francos-arenosos, valores de MO de 0,66% y 0,48%; Fe:
16,90 y 14,70 (ppm); P: 3,0 y 7,0 (ppm) y pH de 5,80 y 5,80 para fincas en las
comunidades de Santa Cruz Isidro y Los Aleo, respectivamente. Nuestro sitio de
estudio, ubicado en la comunidad de Bajo Bonito, presentó un suelo arcilloso
con un pH de 6,31 por lo que se considera poco ácido, en cuanto a los
nutrientes esenciales tenemos alto contenido de fósforo y medio de materia
orgánica y hierro.
Análisis estadístico
Para
evaluar el rendimiento del biol se tomó el peso acumulado de cada tratamiento
en tres cosechas. En el gráfico caja y bigotes Figura 4 se muestra que el
tratamiento 5 (T5) presenta la mediana Q2 por arriba del valor promedio (1,048)
kg y en la Figura 5 se compara el T5 vs el control.
El tratamiento 4 (T4)
resulto ser el más eficiente para aumentar la concentración de clorofila en las
hojas de culantro, ya que presento la mediana por encima del valor promedio
(40,81), tal y como se muestra en el gráfico de caja y bigotes Figura 6 y en la
Figura 7 se compara el T4 vs el control (T6).
Determinar la dosis optima del biol para el
cultivo del culantro permite una mayor optimización de los recursos para los
productores. Cárdenas y Hondoy (2017) estudiaron para su
trabajo de graduación el efecto del biol como fertilizante orgánico en tres cultivares
de Pennisetum purpureum, llegando a la conclusión de que el uso de biol
en combinaciones de Urea 25% o Urea 50% resultan ser combinaciones más eficaces
que el uso de biol 100%. Presentando así aproximaciones cercanas a nuestros
resultados, ya que una mayor cantidad de biol no asegura un mejor rendimiento
por cosecha. De igual manera, es importante tener en consideración que para
nuestro estudio se trabajó con un suelo libre de agroquímicos y las cepas
encontradas en el biol son nativas del área, lo que explica porque con el
tratamiento 6 correspondiente al control (18 L de agua) se obtuvo un buen
rendimiento.
CONCLUSIONES
· Las 34 cepas aisladas mostraron la capacidad de ser promotoras de
crecimiento vegetal en diferentes pruebas, resaltando en la producción de
sideróforos.
· Los tratamientos mostraron ser eficientes para aumentar el rendimiento
del cultivo del culantro coyote (Eryngium
foetidum L.), y con menor cantidad de biol se obtuvieron los mejores
resultados.
· El tratamiento 5 y con 100 ml de biol en 17,90 L de agua, resultó ser la
dosis óptima para la fertilización del culantro coyote.
· El suelo de studio mostró tener un buen contenido de material orgánica y
nutrients por lo que se considera apto para el cultivo del culantro coyote.
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