IDENTIFICACIÓN DE LA
BACTERIA CAUSANTE DE HUANGLONGBING[1]
Carmen
Bieberach-Forero [2]; Zanya Aguilar-Reyes2;
Melvin Jaén2
RESUMEN
El
objetivo del
trabajo fue identificar la bacteria causante de Huanglongbing (HLB) en las
áreas de producción de cítricos, para esto se
colectaron muestras foliares en plantaciones comerciales y huertos caseros en
las provincias de Bocas del Toro, Chiriquí, Coclé, Herrera, Panamá Oeste y
Veraguas. También se analizaron muestras del Banco de Germoplasma de Cítricos
de IDIAP. El ADN se obtuvo mediante el método CTAB 2X. Se realizó la PCR con
iniciadores específicos para identificar HLB: OI1/OI2c, OI2/23S1, HLB65/HLB66,
GB1/GB3 y cebador 226pb. Los productos de PCR se visualizaron a través de
electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Se obtuvieron las secuencias de 10
muestras de cítricos que corresponden a naranja criolla, limón criollo, lima
Rangpur y naranja agria, de plantaciones comerciales y de traspatio. En las
muestras del Banco de Germoplasma de cítricos de IDIAP y en las muestras de mirto (Murraya paniculata L.) no se encontró
el HLB. Las secuencias obtenidas con los iniciadores HLB65/HLB66 y OI1/OI2c
prueban que el agente causal de HLB en Panamá es Candidatus Liberibacter
asiaticus.
Palabras clave: ADN,
Candidatus Liberibacter asiaticus,
Citrus spp., PCR.
IDENTIFICATION OF THE BACTERIA CAUSING
HUANGLONGBING
ABSTRACT
The objective of this study was to identify the bacterial agent
responsible for huanglongbing (HLB) in citrus production areas of Panama. Leaf
samples were collected from commercial citrus plantations and home orchards in
the provinces of Bocas del Toro, Chiriquí, Coclé, Herrera, Panamá Oeste, and
Veraguas. Samples from the IDIAP Citrus Germplasm Bank were also included.
Genomic DNA was extracted using the 2× CTAB method. Polymerase chain reaction
(PCR) assays were performed using specific primer sets for HLB detection,
including OI1/OI2c, OI2/23S1, HLB65/HLB66, GB1/GB3, and a 226-bp primer pair.
PCR products were visualized by agarose gel electrophoresis. DNA sequencing was
conducted on ten citrus samples, including Creole orange, Creole lemon, Rangpur
lime, and sour orange, obtained from commercial and backyard plantations. HLB
was not detected in myrtle samples or in samples from the IDIAP Citrus
Germplasm Bank. Sequence analysis of amplicons generated with primers
HLB65/HLB66 and OI1/OI2c confirmed that the causal agent of HLB in Panama is Candidatus
Liberibacter asiaticus. These results provide molecular confirmation of the
presence of the HLB pathogen in affected citrus production areas and contribute
to disease surveillance and management efforts in the country.
Keywords: DNA,
Candidatus Liberibacter asiaticus, Citrus spp., PCR.
INTRODUCCIÓN
El HLB se reportó en Panamá por primera vez en el 2016, en las
comunidades de Guabito y Las Tablas, en la provincia de Bocas del Toro (Arcia
Tejedor, 2016). Declarando el Ministerio de Desarrollo Agropecuario de Panamá
(MIDA), el estado de emergencia nacional fitosanitaria a través de la
Resolución N°OAL-039-ADM-2016 (Gaceta Oficial Digital 27991 del jueves 17 de
marzo de 2016) y puso en marcha un plan de contingencia para contener la
enfermedad, incluyendo un programa de certificación y producción de material
vegetativo sano.
En 2018 la Convención Internacional de Protección Fitosanitaria (CIPF)
registró la presencia de Huanglongbing
(HLB) en Panamá como plaga presente, no ampliamente distribuida y bajo control
oficial, aunque señalaba que se había dispersado dentro de la provincia de
Bocas del Toro 119 km, desde Las Tablas y Guabito, distrito de Changuinola,
hasta Paso Catalina en el corregimiento de Punta Peña, distrito de Chiriquí
Grande. En 2021 el MIDA detectó un brote en árboles de traspatio en El Valle de
Antón, provincia de Coclé y emitió una alerta fitosanitaria a través de la
Resolución N˚ OAL-051-ADM-2021 (Gaceta Oficial Digital N° 29251-A de 19 de
marzo de 2021).
El objetivo de esta investigación fue identificar la
bacteria causante de HLB en las áreas de producción de naranja en Panamá.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se
colectaron muestras foliares
en plantaciones comerciales y huertos caseros en las provincias de Bocas del
Toro, Chiriquí, Coclé, Herrera, Panamá Oeste y Veraguas. Inicialmente, el muestreo estuvo orientado a la identificación
de plantas de cítricos criollos para trabajos de mejoramiento genético y, al
mismo tiempo, se colectaron muestras foliares con síntomas aparentes de HLB
(moteado amarillo de las hojas, nervaduras engrosadas), en zona afectada por
HLB (Bocas del Toro) y zona no afectada (Coclé).
En 2018 se colectaron cuatro muestras en la provincia de Bocas del Toro (Ci7 al Ci10). En 2019
y 2020 se colectaron muestras de diferentes especies de cítricos en la provincia
de Coclé (Ci11 a Ci 52). En 2021 y 2022
se colectaron muestras en Bocas del Toro, Coclé, Chiriquí, Herrera, Panamá
Oeste y Veraguas. En este período se obtuvieron seis muestras de mirto (Murraya paniculata L.),
planta hospedero del insecto Diaphorina citri, vector de HLB.
Se colectaron muestras del Banco de Germoplasma de
Cítricos de Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá (IDIAP), en 2020 y
2022, con la finalidad de verificar que los materiales estuvieran libres de
HLB. El ADN de 255 muestras de cítricos y seis muestras
de mirto se obtuvo mediante el método CTAB 2X.
El diseño experimental fue completamente al azar. Se realizó PCR a cada
muestra con cinco cebadores específicos para identificar HLB: OI1/OI2c, OI2/
23S1, HLB65/ HLB66, GB1/GB3 y cebador 226F/226R, además se utilizó el
cebador para bacterias 27F/1492R. Se repitió la PCR al menos dos veces para
cada muestra y cebador. La información sobre las secuencias de los cebadores,
la temperatura de hibridación, tamaño de producto y región blanco se describe
en el Cuadro 1.
Los productos de PCR se
visualizaron a través de electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, en búfer de
corrida TBE 0,5X, a 90 Voltios constantes, durante 2:30 horas. Los productos de
PCR fueron secuenciados por Macrogen S.A. (Corea del Sur). Las secuencias se
analizaron con la herramienta de alineamiento local BLAST nucleotide del
National Center for Biotechnology Information (NCBI). https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
RESUSLTADOS
Y DISCUSIÓN
Diversos cebadores han
sido diseñados para el diagnóstico de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Candidatus
Liberibacter africanus (CLaf) y Candidatus
Liberibacter americanus (CLam), para diferentes genes diana: 16S rRNA, la
región intergénica 16S/23S rRNA, el gen β-operón, nusG-rplK, el gen OMP, el gen
profago hipervariable hyvI y hyvII, rplA-rplJ, CLIBASIA_01645,
CLIBASIA_RS01220, entre otros (Kokane et al., 2020; Nugroho et al., 2025).
El desarrollo de cebadores específicos se considera necesario para
ampliar la base de datos de marcadores moleculares que permita mejorar la
detección de HLB y el análisis de la diversidad genética del patógeno. De
acuerdo con Hong et al. (2019) en los ensayos de detección molecular de HLB
pueden presentarse falsos negativos, por ello se hace necesario usar diversos
cebadores y estandarizar las pruebas.
En este trabajo se utilizaron tres cebadores recomendados en la norma
internacional para el diagnóstico HLB de cítricos (International Plant
Protection Convention [IPPC], 2022): OI1/OI2c y OI2/23S1 para identificación de
CLas y CLaf (Jagoueix et al., 1996) y GB1/GB3 para CLam (Texeira et al., 2005).
Se identificaron dos muestras positivas para HLB con los cebadores OI1/OI2c
(Ci37 y Ci 79) (Figura 1B). No hubo muestras positivas con OI2/23 S1 y GB1/GB3.
El cebador HLB65/HLB66 fue diseñado con base en el gen del
ADN polimerasa M94320 de la bacteria HLB (Tatineni et al., 2008). Con
HLB65/HLB66 hubo cinco muestras de cítricos positivas (Figura 1A), que
corresponden a naranja criolla (Ci36), limón criollo (Ci9, Ci37, Ci37AR), lima
Rangpur (Ci10). Las muestras positivas provienen de huertos caseros de Bocas
del Toro (Ci9, Ci10), huertos caseros de Coclé (Ci36, Ci37, Ci37AR) y
plantaciones comerciales de Coclé (Ci79).
El análisis de las secuencias de
los amplicones HLB65/HLB66 y OI1/OI2c confirmó que el agente causal de HLB en
Bocas del Toro y Coclé es Candidatus
Liberibacter asiaticus (Cuadro 2).
En las seis muestras de mirto analizadas no se encontró el HLB.
Los cultivares conservados en el
Banco de Germoplasma de Cítricos de IDIAP dieron resultados negativos con los
seis cebadores usados en el estudio, lo que indica que las plantas estuvieron
libres de HLB. El análisis del Banco de Germoplasma de Cítricos de IDIAP es
importante, ya que tanto los portainjertos como las naranjas dulces que lo
conforman constituyen una fuente de germoplasma sano para la renovación de
plantaciones comerciales y huertos en Panamá.
El cebador 27F/1492R, que amplifica el
gen 16S rRNA de bacterias, se ha usado para identificar bacterias fitopatógenas
en diversos cultivos (Ragavi et al., 2019, Ferdous, 2024; Santosa et al., 2024;
Lu et al., 2025) y también
microorganismos de control biológico (Mirsam et al., 2022). Este se usó en la
PCR de todas las muestras colectadas. Con el cebador 27F/1492R se obtuvieron
bandas de aproximadamente 1200 pb en las muestras Ci36, Ci76, Ci77, Ci79, Ci81,
Ci174 (Figura 2).
Las secuencias de los productos de
PCR obtenidos con el cebador 27F/1492R identificaron la especie Candidatus Liberibacter asiaticus, aunque el
porcentaje de identidad con las accesiones NCBI fue menor al 90% (Cuadro 3).
Las muestras positivas fueron: naranja criolla (Ci36, Ci79, Ci81), de huertos
caseros de Coclé, en las localidades de La Mata (Río Hato) y Miraflores
(Penonomé); naranja Valencia (Ci76, Ci77) de plantación comercial en Coclé y
naranja agria (Ci174) de huerto casero en Bocas del Toro.
La muestra Ci36 dio respuesta con dos cebadores que identifican Candidatus
Liberibacter asiaticus HLB65/ HLB66 y
27F/1492R, al igual que la muestra Ci79 que dio respuesta con los cebadores
OI1/OI2c y 27F/1492R.
De 255 muestras analizadas, solo 10 plantas dieron resultado positivo
(3,9%) y estuvieron concentradas en dos provincias: Bocas del Toro y Coclé. En
este trabajo no se identificaron muestras positivas al HLB de las provincias de
Chiriquí, Herrera, Panamá Oeste y Veraguas.
Las secuencias obtenidas con HLB65/HLB66 muestran identidad (97- 99%)
con accesiones del GenBank NCBI HQ377374.1, CP001677.5 y CP040636.1 de Florida,
Estados Unidos; la secuencia de OI1/OI2c tiene similitud (98%) con la accesión
KY990821 de Irán y CP131152 del Sur de China; las secuencias derivadas del
cebador 27F/1492R muestran similitud (81% - 88%) con la accesión CP131145 de
CLas del Sur de China.
CONCLUSIÓN
· El agente causal de la enfermedad de
Huanglongbing en Panamá es la bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus, de acuerdo con las secuencias de ADN de las
muestras foliares de cítricos procedentes de huertos caseros y plantaciones
comerciales en las provincias de Bocas del Toro y Coclé.
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