PRIMER REPORTE DEL NEMATODO ENTOMOPATÓGENO Heterorhabditis indica Poinar, 1992 (RHABDITIDA: Heterorhabditidae) EN PANAMÁ[1]
Eric M. Candanedo-Lay[2]
RESUMEN
Palabras clave: Bioprospección, cepa nativa, control biológico, identificación
morfológica, identificación molecular.
FIRST REPORT OF THE ENTOMOPATHOGENIC NEMATODE Heterorhabditis indica
Poinar, 1992 (Rhabditida: Heterorhabditidae) IN PANAMA
ABSTRACT
A bioprospecting survey conducted by the
Nematology Laboratory of the Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá
(IDIAP-NEMALAB) in Colón Province, Panama, resulted in the discovery of a
native strain of an entomopathogenic nematode, morphologically identified as
belonging to the genus Heterorhabditis. Entomopathogenic nematodes are
recognized as effective biological control agents against larval stages of
numerous insect pests, and their efficacy has been demonstrated worldwide,
including in preliminary trials conducted by NEMALAB at the Eastern Agricultural
Innovation Center (CIAOr) of IDIAP in Tanara, Chepo District, Eastern Panama.
Species identification of the native isolate, experimentally designated NEMALAB
1H, was further investigated through detailed morphometric analyses of
hermaphroditic females, amphimictic females, males, and third-stage infective
juveniles (IJ3). The morphometric characteristics obtained were consistent with
those previously reported for Heterorhabditis indica Poinar, 1992.
Molecular analyses subsequently confirmed the morphological identification.
This study constitutes the first confirmed record of H. indica in Panama
and provides the basis for future research on its potential use in biological
control programs.
Key words: Bioprospecting, biological control, morphometric
identification, molecular characterization, native isolate.
INTRODUCCIÓN
Los nematodos entomopatógenos del género Heterorhabditis son microorganismos
utilizados en el control biológico de larvas de plagas insectiles de
importancia en la agricultura (Sánchez-Saavedra
et al., 2012). En
su intestino se aloja la bacteria patógena Photorhabdus
spp., en fase forética o de transportación, en una relación simbiótica obligada
de la que ambos organismos se benefician. Estos nematodos tienen la capacidad
de entrar al hemocele o cavidad interna de las larvas insectiles principalmente
a través de los espiráculos que éstas poseen en la cutícula, a lo largo de los
costados del cuerpo. También pueden penetrar por la abertura oral, por el ano o
por los espacios intersegmentales, avanzando hasta llegar al hemocele.
Una vez en el hemocele liberan la bacteria patógena que se reproduce
rápida y masivamente entrando en una fase patógena que mata la larva insectil
por una infección generalizada o septicemia. Entonces Heterorhabditis y Photorhabdus
entran en una fase de simbiosis mutualista de la que ambos organismos se
benefician, el nematodo alimentándose de las bacterias y reproduciéndose y la
bacteria al ser transportada por el nematodo hasta nuevas larvas insectiles.
Una vez agotado el alimento, las nuevas generaciones del nematodo
entomopatógeno abandonan el cadáver de la larva insectil en busca de larvas
insectiles sanas que infectar.
La cepa nativa del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis sp. denominada NEMALAB
1H fue la primera en ser encontrada, en una bioprospección realizada en una
finca de la localidad de Quebrada Ancha, en el corregimiento Limón, en la
provincia atlántica de Colón, República de Panamá (Candanedo-Lay et al., 2020). El hallazgo se realizó en muestras de suelo
de la rizosfera de un árbol de cacao (Theobroma
cacao L.) con
las coordenadas UTM 17P 0648419, 1026745, a una altitud de 164 metros sobre el
nivel del mar. La cepa fue incrementada y mantenida in vivo, en larvas de la polilla mayor de los apiarios, Galleria mellonella, en el Laboratorio de
Nematología del Centro de Innovación Agropecuaria Oriental (CIAOr) del
Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá (IDIAP), en la comunidad de
Tanara, distrito de Chepo, provincia de Panamá (Bedding & Akhurst, 1975; Hazir et al., 2003; Grewal et al., 2001; Lawrence & Georgis, 2012).
Los bioinsecticidas basados en este nematodo
entomopatógeno, además de su eficacia comprobada, son inocuos al ser humano y a
los animales. A diferencia de los insecticidas químicos, que dejan residuos
tóxicos en el agroecosistema y en los alimentos de consumo humano o animal, son
seguros de aplicar y completamente amigables a los agroecosistemas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para
identificar la especie del género Heterorhabditis a la que pertenece la cepa nativa NEMALAB 1H se realizó
la morfometría de 16 machos, 16 hembras hermafroditas, 16 hembras anfimícticas
y 20 juveniles infectivos (J3) que se presentan en los Cuadros 1 a 5 (Grifaldo-Alcántara et al., 2019; Grifaldo-Alcántara
et al., 2020; Meza-García et al., 2014; Poinar
Jr. et al., 1992). Las mediciones se
realizaron con un microscopio compuesto OLYMPUS BH-2 equipado con un
dispositivo de dibujo o cámara lúcida y fueron expresadas en micrómetros (µm).
Con el fin de realizar la identificación molecular de la cepa nativa
NEMALAB 1H, en el Laboratorio de Agrobiotecnología del IDIAP, en Divisa,
provincia de Herrera, se extrajo el ADN de juveniles infectivos (J3),
mediante el protocolo de extracción CTAB 3x. Se realizó la PCR con los
cebadores ITS 5F (5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’) e ITS 4R (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC
3’) que amplifican el espaciador interno transcrito ITS1-5,8-ITS2 del rADN (ADN
recombinante). Los productos de PCR se visualizaron luego de una electroforesis
en gel de agarosa al 1,5%, en búfer TBE 0,5X, a 90 Voltios constantes, durante
2.5 horas (Joyce et al., 1994; Stack et al., 2000). La secuenciación de los
productos de PCR fue realizada por Macrogen, S.A., en Corea del Sur.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La información morfométrica de los machos de la
cepa NEMALAB 1H en la que se documentan 10 caracteres taxonómicos claves para
la identificación de la especie se presenta en el Cuadro 1. La información se
obtuvo de la medición de 16 especímenes tomados al azar, en la que se observan
caracteres propios de los especímenes machos como son la reflexión testicular,
el largo de la espícula y la longitud del gubernáculo (Abd Elgawad, 2024; Lawrence
& Georgis, 2012). Al final del cuadro
se presentan las sumatorias de cada carácter taxonómico, con sus medias (en
negrillas), la desviación estándar y sus rangos. Estos promedios y sus rangos
pasan a componer el cuadro final de la morfometría de la cepa nativa NEMALAB 1H
que se presenta en el Cuadro 5 (Nguyen & Hunt, 2007). Los machos son de gran importancia en la
identificación de especies del género Heterorhabditis,
requiriendo la medición de diez (10) caracteres taxonómicos, con un total de
160 mediciones. Las microfotografías de la Figura 1 muestran las bursas de tres
especímenes macho cuyas papilas genitales están numeradas de uno a nueve en la
Figura 1C (no se aprecian las nueve papilas genitales correspondientes al lado
opuesto de la imagen (son nueve papilas en cada lado), con la 8 y la 9 de menor
tamaño, sin alcanzar el borde de la bursa. De manera similar se organizaron los
datos morfológicos propios de las demás etapas del ciclo de vida: hembras hermafroditas, hembras
anfimícticas y juveniles infectivos (J3).
Las mediciones de nueve caracteres taxonómicos, realizadas en 16 hembras
hermafroditas de primera generación, para un total de 144 mediciones se
observan en el Cuadro 2. Estas hermafroditas superan ampliamente, en longitud
total del cuerpo, a las demás etapas del ciclo biológico. Se auto fecundan y
producen la segunda generación de machos y hembras anfimícticas, que se
reproducen por cruzamiento entre el macho y la hembra, así como las
subsiguientes generaciones, hasta que se agota el alimento (bacterias Photorhabdus y detritos del cuerpo de la
larva insectil) y los juveniles infectivos J3 abandonan el
cadáver en busca de nuevas larvas insectiles.
Las mediciones microscópicas provenientes de 16
hembras anfimícticas que se reproducen sexualmente con los machos y que
pertenecen a la segunda generación del nematodo, en un total de nueve
caracteres taxonómicos y 144 mediciones, se observan en el Cuadro 3. Pueden
ocurrir varias generaciones sub siguientes en el hemocele de la larva insectil
hospedera, en dependencia de su tamaño (a mayor tamaño, más bacterias Photorhabdus sp. y detritus del
hospedero para alimentarse) u otros factores. El largo total promedio del
cuerpo de estos especímenes (1628,65 µm) es mucho menor que el de las hermafroditas (3176,98
µm), pero supera el de los machos (1085,30
µm) y los juveniles infectivos J3 (579,67
µm).
Se realizó la morfometría de 20 juveniles infectivos (J3) de la
cepa nativa NEMALAB 1H en diez (10) caracteres taxonómicos que fueron medidos,
para un total de 200 observaciones (Cuadro 4). Cuando el juvenil infectivo (J3)
entra al hemocele de la larva insectil continúa su ciclo de vida, muda y se
desarrolla en una hembra hermafrodita de primera generación que, al auto
fecundarse, genera juveniles J1, J2, J3, J4
(pre adulto), machos y hembras anfimícticas, de segunda generación que, por
reproducción cruzada, dan origen a las siguientes generaciones, hasta que las
bacterias Photorhabdus y los detritos
en el cadáver de la larva la insectil se agotan y los J3 infectivos
salen al ambiente en busca de nuevas larvas insectiles hospederas que
parasitar.
La morfometría completa de la cepa NEMALAB 1H del
género Heterorhabditis se presenta en
el Cuadro 5. Se deriva de los valores promedio que se observan al final de los
Cuadros de 1 a 4 (última línea en negritas y últimas dos líneas con los
respectivos rangos). Las mediciones morfométricas obtenidas están dentro de las
aceptadas para la especie Heterorhabditis
indica, descrita originalmente por Poinar
et al., 1992.
En las microfotografías de la Figura 2, se
muestra imágenes originales del juvenil infectivo J3 y su diente
dorsal, de la hembra anfimíctica y del macho y su bursa pelodera. Adicional, Se
observa el ADN de juveniles infectivos
(J3) de las cepas nativas NEMALAB 1H, NEMALAB 14H, NEMALAB 16H y
NEMALAB 17H, mediante el protocolo de extracción CTAB 3x en la Figura 3.
ADN de juveniles infectivos (J3) de las cepas nativas NEMALAB
1H, NEMALAB 14H, NEMALAB 16H y NEMALAB 17H, mediante el protocolo de extracción
CTAB 3x.
CONCLUSIONES
· Tanto las mediciones morfométricas realizadas bajo microscopio compuesto
de luz, como el análisis molecular, indicaron que la especie de la Cepa Nativa
NEMALAB 1H corresponde a la especie reportada como Heterorhabditis indica, que se está reportando por primera vez en
la República de Panamá.
· El cuerpo de los machos es de mayor longitud, con una media de 1085.30
µm. Ambos procedimientos se complementan, pero la morfometría aportó
información de forma, estructura y métrica que describen detalladamente la especie
encontrada y que son de gran utilidad para investigadores que no tienen acceso
al análisis molecular o desean comparar diferencias anatómicas entre individuos
de una misma especie.
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